钙拮抗剂硝苯吡啶对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用

谷思洋，邓立菊，姜宏宇

（1.吉林大学第一医院 干部病房，吉林，长春 130021；2.大庆龙南医院，黑龙江，大庆 163453）

钙拮抗剂硝苯吡啶对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用

谷思洋1，2，邓立菊2，姜宏宇1＊

（1.吉林大学第一医院 干部病房，吉林，长春 130021；2.大庆龙南医院，黑龙江，大庆 163453）

目的 研究钙拮抗剂（Calcium antagonists）硝苯吡啶（Nifedipine）对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。方法30只体重在260-300g的 Wistar雄性大鼠随机分为三组：对照组、模型组、Nifedipine组（1μmmol／L）。大鼠麻醉后取出心脏，悬挂于Langendorff灌流装置上行主动脉逆行灌流，制备大鼠离体心脏缺血30min、再灌注120min模型；对照组行150min正常灌流。测定心肌梗死面积，检测SOD（Superoxidedismutas超氧化物歧化酶）及 MDA（malonaldehyde丙二醛）的含量，免疫组化方法行PKCδ（The protein kinase C蛋白激酶C）的测定，用RT-PCR法测定NCX（Na＋／Ca2＋exchanger钠钙交换体）及SERCA2α（Sareoplasmie reticulum calcium adenodine triphosphatase肌浆网钙泵）的表达。结果硝苯吡啶组心肌梗死面积较模型组明显缩小（P＜0.01）；冠脉灌流液中SOD活性明显升高（P＜0.01）；MDA含量显著下降（P＜0.01）；药物组的PKC含量水平较模型组增多（P＜0.05），药物组 NCX mRNA的表达水平较模型组降低，存在显著差异（P＜0.05）。结论钙拮抗剂Nifedipine对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用。

硝苯吡啶（Nifedipine）；缺血／再灌注；心肌梗死；钠钙交换体（NCX）

（ChinJLabDiagn，2012，16：0210）

本研究采用大鼠离体心肌缺血／再灌注模型，观察Nifedipine对缺血／再灌注心肌损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与仪器

体重在260-300g的wistar雄性大鼠（吉大动物实验中心，动物合格证号：SCXK—吉2007-0003）；Langendorff灌流装置（成都泰盟科技有限公司）；分光光度计（上海尤尼柯有限公司）；BI-2000图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）；OLYMPUS显微镜。

1.2 药品与试剂

1.2.1 硝苯吡啶（Nifedipine），购自瑞士 Enzo life sciences公司。溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成1mmol／L贮备液，分装成300μl小瓶，4℃冰箱中保存，应用前取出37℃水浴中融化。用KH液稀释成1μmol／L浓度。

1.2.2 KH 工作液 NaCl 6.92g，NaHCO32.1g，KC1 0.35g，CaC120.2g，MgSO40.14g，KH2PO40.16g，葡萄糖2.0g，加去离子水1000ml，在磁力搅拌机上充分搅拌溶解，溶解后将pH调整为 （7.4±0.5）。

1.2.3 TTC染液 将0.5g TTC粉末加入装有50 ml 1×PBS液的棕色瓶中，37℃水浴箱中15min，振荡，制成TTC溶液，现用现配。SOD、MDA试剂盒由南京建成生物公司提供。PKCδ抗体由美国SAB signalway antibody生物工司提供。Trizol、DEPC、M-MLV反转录酶、Taq酶（宝生物工程大连有限公司）；引物由上海生工生物技术有限公司合成；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 实验方法

1.3.1 离体大鼠心脏Langendorff灌流模型制备

测大鼠体重，以0.4g／kg水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹腔内注入5mg／kg肝素钠，开胸，迅速摘出心脏置于预先用95%O2＋5%CO2混合气体（1.5L／min）所饱和的4℃KH液中。经主动脉逆行插管悬挂于Langendorff灌流装置上，调整悬挂位置使左、右冠脉分别得到充分的灌流，保持自搏心率，在10 kPa恒压、37℃恒温下以1.5L／min 95%O2＋5%CO2流量通气，充分氧合的KH液按10ml／min灌流，剪去左心耳，将充水导管球囊插入左心室，向球囊内注水约0.2－0.4ml，将左心室舒张压调至1.1 kPa以上，记录灌流压、左心室压力（美国MP150多导电生理记录仪）及灌流量，稳定后15min后开始心肌缺血再灌注模型的制备。

1.3.2 大鼠心脏缺血／再灌注的模型制备 选择30 min的不完全缺血（即将左、右冠脉灌流量减到原灌流量的5%）及2h再灌注（10ml／min的KH液）。

1.3.3 试剂稀释及实验分组 将预先分装的硝苯吡啶，用KH液释成1μmol／L浓度。将30只大鼠随机分为3组，每组10只。组一：对照组；组二：为模型组；组三：在缺血时向主动脉内注入1μmol／L钙拮抗剂硝苯吡啶（硝苯吡啶组）。

1.4 检测指标

1.4.1 SOD、MDA及心肌梗死面积检测 收集灌流结束前1min的冠脉流液，根据试剂盒测量SOD、MDA的活性。实验结束时取下心脏放入-20℃冰箱中冷冻1h，然后将心脏以心尖为起点切成1mm间隔横断切片，放入37℃氯化三苯基四氮唑（TTC）中染色30min，再置于4%多聚甲醛液中24h，于吉林大学设备处进行实体图像采集，梗死区（TTC未染色的白色区）和非梗死区 （TTC染成红色区），然后用BI-2000图像分析系统计算心肌梗死面积（即梗死面积占全心面积的百分比）。

1.4.2 心肌PKCδ表达 免疫组织化学染色法：取心肌标本4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，做成5μm切片，行HE染色。SP法行PKCδ免疫组织化学染色。切片常规脱蜡至水，置入3%H2O2孵育15 min，以封阻内源性过氧化物酶。PBS浸泡3min×2次；用0.01M柠檬酸盐缓冲液抗原修复自然冷却后取出，PBS冲洗3min×2次。滴加山羊血清封阻，室温下孵育10min。滴加PKCδ一抗（1∶100稀释）37℃湿盒中孵育75min。PBS冲洗3min×3次。滴加生物素标记的二抗，湿盒中37℃孵育20 min。PBS冲洗3min×3次。滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素，37℃孵育15min。PBS冲洗3 min×3次。DAB显色1min，自来水冲洗10min，苏木精复染1min，自来水冲洗10min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在阴性对照切片中，滴加PBS替代PKCδ单克隆抗体，其余步骤不变。心肌PKCδ表达鉴定：细胞呈棕黄色染色者为阳性细胞，利用BI-2000图像分析软件分析组化图片平均光密度值。

1.4.3 NCX与SERCA 2α的 mRNA表达 NCX与SERCA2α行RT-PCR：用Trizol抽提总RNA，测定RNA浓度和纯度。取4μg总RNA反转录生成cDNA文库。1μl模板用于目的基因的PCR扩增。引物顺序为SERCA2a，上 游 引 物：5′-ATGAGATCACAGCTATG ACTGGTG-3′，下 游 引物：5′-GCATTGCACATCTCTATGGTGACTAG-3′，产物：620bp；NCX，上游引物：5′-AATGAGCTTGGTGGCTTCACA-3′，下 游 引 物：5′-CCGCCGATACAGCAGCAC-3′，产物：861bp；GAPDH（内 参 照 ），上 游 引 物：5′-GCCATCAACGACCCCTTCATTG-3′，下 游 引 物：5′-TGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3′，产物：597bp。反应条件为SERCA2a：94℃ 5min，94℃ 3min，56℃30s，72℃30s，35次循环，72℃ 10min；NCX：94℃ 5 min，94℃3min，53℃30s，72℃30s，35次循环，72℃10min；G APDH：94℃5min，94℃3min，56℃30s，72℃30s，35次循环，72℃10min。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行灰度扫描，用靶基因／GAPDH表示靶基因mRNA相对表达水平。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 SOD及MDA的影响大鼠离体心脏经过15 min平衡灌注，30min不完全缺血及2h再灌住，冠脉灌流液中，硝苯吡啶同模型组比较，SOD活性明显升高（P＜0.01），MDA 含量显著下降（P＜0.01）。见表1。

表1 大鼠离体心脏冠脉流液中SOD、MDA含量比较（±s，n＝10）

表1 大鼠离体心脏冠脉流液中SOD、MDA含量比较（±s，n＝10）

注：与模型组比较，★P＜0.01

组别 SOD（U／ml） MDA（nmol／ml）4.432±2.068 0.703±0.142硝苯吡啶组 5.876±3.047★ 0.517±0.088模型组★

2.2 对大鼠离体心脏心肌梗死面积的影响对照组无心肌梗死出现；硝苯吡啶组梗死面积较模型组明显减小，与模型组比较差异有显著性（P＜0.01）。见表2。

2.3 HE染色与PKCδ表达结果心肌组织HE染色后400倍光镜下见：对照组：心肌细胞排列规则，无间质水肿；模型组：心肌细胞间质水肿，肌纤维肿胀，排列无序，横纹消失，肌浆内出现空泡变性，可见较多粒细胞灶状浸润，并可见少量红细胞渗漏，个别细胞出现溶解、坏死；药物组：心肌细胞轻度水肿，界限清楚，细胞排列相对规则，间质无水肿，可见少量中性粒细胞浸润，无红细胞渗漏。通过对心肌组织PKC平均光密度的研究发现，对照组的PKC表达水平较低，缺血再灌注组PKC表达较对照组增多，且主要分布于胞浆中；硝苯吡啶组PKC水平较缺血再灌注组药物组均能使PKC含量增加（P＜0.01），并能使心肌细胞的PKC从细胞核或细胞浆移位到细胞膜上，分布发生改变。见表3。

表2 各实验组在缺血再灌注损伤中的心肌梗死面积比较（±s，n＝10）

表2 各实验组在缺血再灌注损伤中的心肌梗死面积比较（±s，n＝10）

注：与模型组比较，★P＜0.01

组别 梗死面积（%）对照组 无模型组 31.6±0.081硝苯吡啶组 21.6±0.091★

表3 心肌组织免疫组化PKC表达平均光密度的比较（±s，n＝10）

表3 心肌组织免疫组化PKC表达平均光密度的比较（±s，n＝10）

注：与正常组比较，●P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.01

组别 n 10 0.237±0.018模型组 10 0.296±0.011●硝苯吡啶组 10 0.321±0.014平均光密度对照组★

2.4 NCX及SERCA2αmRNA表达扩增条带清晰明亮，与预先设计的 NCX、SERCA2α、GAPDH基因片段大小一致 （图5）。模型组NCX mRNA的表达比正常组显著升高（P＜0.01）；硝苯吡啶组NCX mRNA的表达水平较模型组降低，存在显著差异（P＜0.01）。模型组SERCA2αmRNA的表达比对照组显著降低（P＜0.01）；硝苯吡啶组SERCA2αmRNA的表达水平较模型组显著增高（P＜0.01）。见表4。

表4 各组NCX1mRNA和SERCA2αmRNA表达比较（±s，n＝10）

表4 各组NCX1mRNA和SERCA2αmRNA表达比较（±s，n＝10）

注：与对照组比较，●P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.01

组别 n NCX1／GAPDH SERCA2α／10 0.236±0.059 0.487±0.049模型组 10 0.457±0.068● 0.154±0.053●硝苯吡啶组 10 0.305±0.047★ 0.204±0.041 GAPDH对照组★

3 讨论

一般所称钙拮抗剂（Calcium antagonists），是指阻滞离子从胞外经钙通道流入胞内的药物，能抑制跨膜钙内流及细胞内的钙释放，降低细胞内游离钙浓度及其利用率，抑制ATP酶的活性，降低心肌收缩力；使平滑肌细胞松弛，血管扩张，降低外周血管阻力［1］。由于钙拮抗剂增加缺血区血流，负性肌力作用又降低了局部代谢，有利于维持缺血心肌的氧供需平衡，因此可缩小缺血范围，减轻局部代谢紊乱及再灌注性细胞损害的程度。钙拮抗剂通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞内钙浓度、拮抗钙超载，治疗心肌缺血再灌注损伤已成为目前的一种共识［2－5］。在心肌缺血后坏死尚未形成前给药效果更佳。有报道证实［6］：应用钙离子拮抗剂对损伤的心肌细胞有一定的保护作用，对改善心肌功能有明显的效果。

本实验为Langendorff灌流装置上行主动脉逆行灌流，制备大鼠离体心脏缺血30min、再灌注120 min模型，模拟临床上心肌缺血-再灌注损伤患者的病理生理过程，观察硝苯吡啶对离体大鼠心脏的保护作用。结果显示，硝苯吡啶组心肌梗死面积较模型组、对照组明显缩小（P＜0.01），药物对离体大鼠心肌有保护作用。MDA为氧自由基攻击生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的终产物，其值间接反映机体组织细胞受自由基损伤程度；SOD为细胞内一种抗氧化酶，它可清除超氧阴离子，保护机体免受氧自由基损伤，其值间接反映机体清除氧自由基的能力，缺血再灌注时自由基生成增加，同时其清除能力下降，脂质过氧化加强；应用药物后冠脉灌流液中SOD活性明显升高（P＜0.01）；MDA含量显著下降（P＜0.01），证明药物对大鼠心肌有保护。心肌细胞内游离的Ca2＋浓度升高可直接激活Ca2＋依赖性PKC（a），使其从细胞浆转移到细胞膜上或通过激活Ca2＋依赖性磷酯酶C使与其相联的Gq蛋白激活不依赖于钙的PKC-δ和PKC-ε，使其从胞浆转移到细胞膜上。PKC的激活可引发底物蛋白质磷酸化、细胞内钙稳态、线粒体ATP敏感性钾离子通道、腺苷、缓激肽、受体的信息传递等一系列变化，是一种重要的机体内源性保护中间环节，通过催化多种蛋白质磷酸化，进而对细胞产生保护作用，减轻细胞损伤。药物组的PKC含量水平较模型组增多（P＜0.01）。本研究发现缺血再灌注损伤心肌中PKC的表达较对照组大鼠心肌中测定量高，说明在缺血再灌注后，心肌产生损伤，PKC由静止状态转为激活状态，表达增多，以保护受损伤心肌。心肌缺血再灌注时，钠钙交换体（sodium-calcium exchanger，NCX）反向转运使Ca2＋内流增加，导致细胞钙超载，是缺血再灌注造成细胞结构损伤、心律失常和收缩功能障碍的重要机制［7］，正常心脏的NCX1和SERCA2α在细胞水平上保持相对平衡。NCX是缺血／再灌注时 Ca2＋进入细胞的主要途径［8，9］，阻断NCX介导的钙流入可得到良好的心肌保护作用［10］，肌浆网钙泵（SERCA2α）主要作用是将胞质内Ca2＋摄回至肌浆网内，药物组NCX mRNA的表达水平较模型组降低，存在显著差异（P＜0.01），药物组SERCA2αmRNA的表达水平较模型组显著增高（P＜0.01），实验证明使用硝苯吡啶对离体大鼠心肌有保护作用。钙拮抗剂Nifedipine减轻缺血再灌注心肌细胞损伤，对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用。

［1］Zhang WG.Can we use calcium antagonist better in antihypertensive therapy［J］.Pharmacol Res，1996，34（5／6）：187.

［2］Hoffman JJ，Gilbert TB，Poston RS，et al.Myocardial reperfusion injury：etiology，mechanisms，and therapies［J］.J Extra Corpor Technol，2004，36（4）：391.

［3］Moukarbel GV，Ayoub CM，Abchee AB，et al.Pharmacological therapy for myocardial reperfusion injury［J］.Current Opinion In Pharmacology，2004，4（2）：147.

［4］Gao F F，Hao S Y，Shi G G，et al.Cardiac electrophysiological and antiarrhythmic cffects of N-n-buty haloperidol indide［J］.Cell physiolo Biochem，2010，25（4-5）：433.

［5］Huang Z，Shi G，Gao F，et al.Effects of N-n-buty haloperidol indide on L-type calcium channels and intracellular free calcium in rat ventricular myocytes［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（2）：182.

［6］刘 颖，程 翔，廖玉华.地尔硫卓对心脏缺血／再灌注后心肌炎症的影响［J］.中国药理学通报，2010，2（1）：56.

［7］Christopher RW，Valentino Piacentino Ⅱ，Kenneth SG，et al.Na＋-Ca2＋exchange current and submembrane［Ca2＋］during the cardiac action potential［J］.Circ Res，2002，90（1）：182.

［8］Ohtsuka M，Takano H，Suzuki M，et al.Role of Na＋-Ca2＋exchanger in myocardial ischemia／reperfusion injury：evaluation using a heterozygous Na＋-Ca2＋exchanger knockout mousemodel［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，314：849.

［9］Satoh H，Mukai M，Urushida T，et al.Importance of Ca2＋influx by Na＋／Ca2＋exchange under normal and sodium-loaded conditions inmammalian ventricles［J］.Mol Cell Biochem，2003，242（1-2）：11-17.

［10］Lee C，Hryshko LV.SEA0400：a novel sodium-calcium exchange inhibitor with cardioprotective properties［J］.Cardiovasc Drug Rev，2004，22：334.

Protective Effect of Calcium Antagonist Nifedipine on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Isolated Rat Hearts

GU Si-yang，DENGLi-ju，JIANGHong－yu.（FirstHospital，JilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveStudy the protective effect of Calcium Antagonist Nifedipine，on myocardial ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts.MethodsRat myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by consisting of a 30min（reducing perfusion flow level of left and right coronary to 5%of the original irrigation flow）ischemic period and 2hreperfusion，the isolated rat hearts were perfused on modified Langendorff apparatus.The rats were divided into control group，ischemia／reperfusion（I／R）group，Nifedipine group，then detected the myocardial infarct area，the levels of SOD and MDA，and PKCδwere detected by immunoHistochemistry，Semi-quantitative RT-PCR was employed to measure the mRNA levels of NCX and SERCA2a.Results（1）Compared with the I／R group，the myocardial infarct area was significantly lower，（2）SOD activity increased significantly and MDA decreased significantly；（3）Nifedipine group，compared with model group，levels of PKC increased （P＜0.05）；（4）expression of NCX mRNA in Nifedipine group was lower than the model group，there were significant differences（P＜0.05）；expression of SERCA2αmRNA in Nifedipine group was significantly increased compared with the model group（P＜0.05）.ConclusionThe calcium antagonist Nifedipine on myocardial ischemia-reperfusion injury has a protective effect.

book=211,ebook=93

myocardial infarction；Nifedipine；Ischemia-reperfusion；NCX

R364.1

A

1007－4287（2012）02－0210－04

吉林省自然科学基金资助（201115066）

＊通讯作者

2011－01－08）