苦参碱对小鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元的影响

曹 剑，王永安，魏 壮，刘浩宇，尹维田

（1.赤峰市医院，内蒙古 赤峰024000；2.吉林大学中日联谊医院）

本文对坐骨神经损伤BALB／c小鼠应用苦参碱，通过对坐骨神经相应脊髓节段gap-43的测定和神经LFB染色的观察，探讨苦参碱对周围神经损伤后的修复和再生方面的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

健康成年雄性BALB／c小鼠160只（体重25±2g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供）单侧坐骨神经离断后，常温饲养，普通饮食，自由饮水。随机分为生理盐水空白对照组、高剂量给药组、中剂量给药组和低剂量给药组，其中实验组动物又根据术后存活时间随机分为12h，24h，3d，5d、7d、2 w，4w，8w组，以上各组每组10只动物。

1.2 动物模型制备

坐骨神经损伤模型的制作：BALB／c小鼠经1%硫喷妥钠100mg／kg腹腔麻醉，俯卧位固定，无菌条件下单侧下肢股后部纵切口约2cm，梨状肌下暴露坐骨神经，用玻璃分针钝性小心分离坐骨神经主干和周围组织，在坐骨结节下0.5cm处完全离断坐骨神经，以11／0显微缝线12倍显微镜下吻合坐骨神经，分层缝合肌肉和皮肤。

1.3 给药方法和剂量

采取灌胃方法给药。参照临床应用苦参碱原药剂量，等效换算为腹腔注射用剂量［1］，将此数值作为给药的中等剂量，并以等比数列量确定高低剂量组用量。最终各组给药量为，高剂量组10mg／kg／d，中剂量组5mg／kg／d，低剂量组2.5mg／kg／d，取相应剂苦参碱以生理盐水溶解后腹腔注射。对照组给予同等体积生理盐水。连续给药至处死。

1.5 取材及标本制备

取每组动物5只分别在相应的时间点用1%硫喷妥钠100mg／kg腹腔麻醉后，采用脊柱后方正中切口咬骨钳咬开椎管，切取损伤侧L4－L6段的脊髓，标记后迅速浸置于液氮中备用。

取每组另外5只在相应时间点切取坐骨神经自吻合口（包括吻合口在内）向远端0.6－0.7cm神经干，10%中性甲醛固定标本72小时以上，经酒精逐级脱水后石蜡包埋。

1.6 检测方法

1.6.1 Real-time PCR 法检测 首先进行引物的合成，用 Beacon designer 7软件设计 gap-43、以GAPDH为引物（表1），经检索Blast验证特异性。分别取各时间点的L4－6脊髓节段组织，采用Trizol试剂提取总RNA，以提取的总RNA为模板进行反转录制备cDNA库。以cDNA库为模板，PCR扩增L4－6脊髓节段组织的gap-43，每个反应体系中均加入GAPDH的一对引物作为PCR扩增的内参，反应条件：95℃30s－58℃60s－72℃60s40个循环。

1.6.2 髓鞘固兰染色 切取坐骨神经自吻合口（包括吻合口在内）向远端0.6－0.7cm神经干，10%中性甲醛固定标本72小时以上，经酒精逐级脱水后石蜡包埋，制片行HE染色。观察神经的基本结构及有无细胞增生、炎细胞浸润等改变，初步筛选特染对象。切片脱蜡后，用LFB液60℃浸泡12小时；95%酒精浸泡5min；加入0.05%碳酸锂15s；而后70%酒精洗涤完毕蒸馏水洗涤，脱水透明封片。

表1 Beacon designer 7软件设计GAP43、GAPDH引物

2 结果

2.1 Realtime-PCR分析结果

Gap-43mRNA在正常大鼠坐骨神经组织少量表达，当坐骨神经损伤后，相应脊髓节段组织gap－43mRNA的含量上升，从损伤后12h开始到5d呈现逐渐增加的趋势，各组间差异性明显，其中高中剂量组的增多量明显低于低剂量和对照组。见图1。2w后gap-43在高中剂量组呈持续表达。其中，中剂量组明显促进了gap-43的表达。

图1 各时间点gap-43的mRNA表达

2.2 LFB染色结果

LFB染色后，髓鞘呈天蓝色，轴突不着色，背景为白色。术后8周染色结果见图2。高、中剂量组髓鞘形状规则，厚度较为均一，轮廓明显且周边纤维组织增生不明显；低剂量组髓鞘形状及厚度较不规则，但轮廓尚明显，束间可见纤维结缔组织增生；对照组鞘形状更加不规则，纤维结缔组织增生明显。

图2 造模后各剂量组髓鞘固蓝染色结果

综合以上两组指标的检测，不同时相小鼠L4－6脊髓节段组织中gap-43mRNA的变化，以及髓鞘LFB染色的趋势具有一致性。

3 讨论

苦参碱是广泛存在于豆科植物苦参（sophora flavescents Ait）、苦豆子（S.alopecuroides L）及广豆根（S.subprostrate chunet T.Chenk）等中草药中的有效成份。近年来对苦参碱的研究较为广泛，它的化学式为C15H24N20，属于四环的喹嗪啶类，分子骨架可看作2个喹嗪啶环的杂体。苦参碱具有多种药理作用，对中枢神经系统可引发中枢神经麻痹，可防治脑水肿和镇静、降温作用；对心血管系统，可增强心肌收缩力，抗心律失常、抗动脉粥样硬化；对消化系统，可防治肝炎、抗肝纤维化，利胆、止泻，保护胃肠黏膜；对呼吸系统，具有祛痰平喘作用。此外，还有抗病毒、抗寄生虫、抗炎、免疫调节及抗瘢痕形成等作用［2－4］。而对其促进神经损伤后修复的研究较少。生长相关蛋白gap-43是一种胞膜磷酸蛋白质，是膜快速转运蛋白，与神经元生长发育、突触形成及神经可塑性密切相关［5］。在膜信号转导系统中，G蛋白作为信号转导因子和放大器处于核心地位，gap-43可调控G蛋白［6］。这种作用是通过gap－43的可结合到膜内表面的氨基末端完成的，作为纯化的蛋白质，gap-43起一个鸟苷酸释放蛋白的作用。它可提高从G0蛋白释放GDP、提高GTP激酶活性及与GTP的结合［7］。我们的研究发现：Realtime PCR的检验结果表明坐骨神经损伤后，相应脊髓节段的gap-43被激活并大量表达，应用苦参碱后高中剂量组的gap-43表达明显高于低剂量组及对照组，并与2周后持续表达。坐骨神经损伤后应用苦参碱可以对gap-43的活化起到持续促进作用，促进了神经的再生。

［1］de Oliveira Luiz FC，Edwards Howell GM，Velozo Eudes S，Nesbitt M.Vibrational spectroscopic study of brazilin and brazilein，the main constituents of brazilwood from Brazil［J］.Vib Spectrosc，2002，28：243.

［2］Kim JK.Illustrated natural drugs encyclopedia［M］.Seoul；Namsandang Publishers；1989：79.

［3］黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算［J］.中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1069.

［4］刘 梅，刘雪英，程建峰.苦参碱的药理进展［J］.中国中药杂志，2003，28（9）：801.

［5］Benowitz L I，Routtenberg A.GAP-43：an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity［J］.Trends Neurosci，1997，20 （2）：84.

［6］Fishman MC.GAP243：Putting constraints on neuronal plasticity［J］.Perspective in developmental neurobiology，1996，4：193.

［7］Dani JW，Armstrong DM，Benowitz L I.Mapping the development of the rat brain by GAP-43Immunocytochemistry［J］.Neuroscience，1991，40（1）：277.