大肠癌易感基因hMLH1、hMSH2的筛查

侯睿智，安治国，魏 君，毛静涛，侯治富＊

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033；2.北京龙迈达科技有限公司，北京 100176）

大肠癌易感基因hMLH1、hMSH2的筛查

侯睿智1，安治国1，魏 君1，毛静涛2，侯治富1＊

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033；2.北京龙迈达科技有限公司，北京 100176）

目的 探讨hMLH1、hMSH2基因多态性与大肠癌发病危险的研究。方法采用大样本随机对照试验，运用PCR和DNA直接测序方法，筛查外周血单个核细胞DNAhMLH1、hMSH2基因多态性。结果大肠癌组hMLH1-exon12 1151T→A的突变阳性率为12.20%，与对照组（6.10%）相比，无显著差异（P＞0.05）；而hMSH2-exon1 IVS1＋9C→G的突变阳性率为46.70%，与对照组（33.33%）相比差异显著（P＜0.05）。在各年龄组间，hMLH1-exon12、hMLH1-exon12突变无显著性差异（P＞0.05）。危险性分析表明，携带hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变发生大肠癌的相对危险性为无基因突变组的1.75倍，若不携带基因突变，其肠癌发病率将降低42.9%；若在人群中无hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变发生，则大肠癌的发病率将降低20%。结论hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变可作为大肠癌发病的危险因素，并可作为检测指标。

大肠癌；多态性；hMSH2

（ChinJLabDiagn，2012，16：0049）

hMSH 2基因位于染色体区域2p 21，在遗传连锁分析中，是最早被确定的影响遗传性非息肉性大肠癌（HNPCC）综合征的一个重要的候选基因。其编码产物hMSH 2蛋白与hMSH 6或hMSH 3形成异二聚体，并以异二聚体复合物的形式识别、结合DNA复制中的错误位点，借以消除子代序列中的错误，使DNA复制按照母模板序列正常复制。

hMLH1基因位于染色体3p 21－23，与hMSH 2基因一样与HNPCC有关。其基因编码产物hMLH1蛋白本身无酶活性，与hMLH3，hPMS2或hPMS1形成异二聚体，借以结合其他的DNA修复蛋白。

早期的研究表明，hMSH2基因的16个外显子和hMLH1基因的19个外显子都能发生致病性突变。目前尚没有关于这两个基因致病性突变、或是多态性的评价标准。在本项研究中，试图通过大样本随机对照试验，探索在大肠癌中这种突变的致病性或致病危险性。

1 对象与方法

1.1 患者选择与分组150例大肠癌患者均为2007年－2009年吉林大学中日联谊医院住院病例。其中，男性86例，女性64例；平均年龄为49.5岁。诊断标准采用全国大肠癌病理研究协作组2002年制定的《全国大肠癌病理研究统一规范》。另选取150例健康体检者作为对照，其中男性79例，女性71例；平均年龄47岁。

1.2 去静脉全血，分离单个核细胞提取DNA，用QIAGEN旋转柱纯化样本。

1.3 PCR扩增目的基因片段由宝生物工程（大连）有限公司合成引物。hMLH1-exon12上游引物5′-ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG-3′，下 游引 物 5′-TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG-3′。hMSH2-exon1上游引物 5′-TCGCGCATTTTCTTCAACC-3′，下 游 引 物 5′-GTCCCTCCCCAGCACGC-3′。PCR循环参数为：充分变性95 ℃、5 mins，变性95℃、40s，退火55℃、40s，延伸72℃、60s。35个循环，再充分延伸72℃、5mins。经琼脂糖电泳鉴定PCR产物。

1.4 DNA序列测定PCR反应管内加入1μl的3M醋酸钠，1μl EDTA和25μl无水乙醇，吹打混合均匀。室温放置15－30min，12 000rpm，4℃15－20min离心，小心吸弃溶液，加入70%的乙醇漂洗，12 000rpm，4℃8－10min离心，再次加入70%的乙醇漂洗，上述条件离心，开盖闭光晾置，至残余酒精彻底挥发干净，使PCR产物纯化。加入10μl hidi（甲酞胺），95℃变性2－3min，立即冰浴，即可上机。比较在测序图上的相应碱基序列峰型，如果出现峰型重叠，根据峰型的颜色、波幅，判定置换的碱基。

1.5 统计方法采用SPSS13.0统计软件，对hMSH2基因IVS1＋9C→G、hMLH1基因1151T→A多态性进行危险度（Risk）分析和等级相关分析。

2 结果

2.1 PCR扩增结果对150例健康体检者、150例大肠癌患者外周血单个核细胞DNA进行hMLH1-exon12、hMSH2-exon1 扩 增 后，分 别 在 216bp 和281bp处获得了扩增产物。其中有147例健康体检者、82例大肠癌标获得hMLH1-exon12扩增出结果；126例健康体检者、90例大肠癌标本获得hMSH2-exon1扩增出结果。

2.2 DNA序列分析结果对147例健康体检者和82例大肠癌患者hMLH1-exon12扩增PCR产物进行DNA序列分析（结果见表1，2）。

统计结果表明，大肠癌组的突变阳性率为12.20%，与对照组（6.10%）相比，无显著差异（P＞0.05）。

Tab.1 hMLH1-exon12 1151T→A in colorectal cancer patients

Tab.2 hMLH1-exon12 1151T→A in colorectal cancer of different ages

在各年龄组间，hMLH1-exon12 1151T→A突变阳性率的Kendall等级相关分析表明，无显著性差异，χ2近似于零，P＞0.05）。

对126例健康体检者和90例大肠癌患者hMSH2-exon1扩增PCR产物进行DNA序列分析（结果见表3，4）。

Tab.3 hMSH2-exon1IVS1＋9C→G in colorectal cancer patients

结果表明，大肠癌组的突变阳性率为46.70%，与对照组（33.33%）相比差异显著（P＜0.05）。

危险性分析表明，携带hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变发生大肠癌的相对危险性（OR）为无基因突变组的1.75倍；在对照组中，若不携带基因突变，其肠癌发病率将降低42.9%（特异危险性百分比AR%）；若在人群中无hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变发生，则大肠癌的发病率将降低20%（人群特异危险性百分比PAR%）。

Tab.4 hMSH2-exon1IVS1＋9C→G in colorectal cancer of different ages

在各年龄组间，hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变阳性率的Kendall等级相关分析表明，无显著性差异（χ2＝0.139，P＞0.05）。

3 讨论

大肠癌（Colorectal cancer，CRC）是全球第三个最常见的癌症，位居肺癌和乳腺癌癌症之后。60%发生在较发达地区。按年龄标准化率和累计计算，0－74岁人群中大肠癌的发病率和死亡率有明显的地理变异。在世界各地，捷克发病率最高（43／10万），非洲（3.6／10万，除南非）和中南亚（4.5／10万）发病率最低。欧洲CRC死亡率最高，中非地区死亡率最低。

根据中国卫生部2002年的报告，结直肠癌的发病率已由70年代的第6位升至90年代的第3位，并且年死亡率上升至10.25／10万，在世界范围内处于较低水平［1－4］。

大肠癌的确切病因仍不清楚，随着人们对家族性腺瘤性息肉病、遗传性非息肉性大肠癌认识的深入，追寻遗传标志筛查大肠癌成为当今的热点。本课题组的前期研究也表明，大肠癌p53基因突变率为44%，并于ras基因协同突变［5，6］。揭示了大肠癌发生演变中的遗传因素的作用。

关于MMR基因突变，国内外有较多的文献报道。特别是在遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）的研究中，己有大量的错配修复基因突变资料的积累。在HNPCC中绝大多数的肿瘤是由hMSH2和hMLH1基因的胚系突变引起的，其中hMSH2基因的突变占31%，hMLH1占33%。在散发性结肠癌和胃癌中，己报道的hMLH1基因的突变（42%），较hMSH2基因高（8%）［7］。

有研究发现，至少在白人中hMLH1的 WS14－19多态位点的A和G两种基因型，预实验的数据提示这种多态与部分直肠癌的发病有关。Hutter等报道，在结直肠癌患者中hMLH1的突变型IVS14-19G基因型较正常人群的高，分别为55.5%和39.2%，相关危险性G是A的1.93倍。除了荷兰患者组，其余各组亦得到相同结果。错配修复基因PMs2中的SNPs与MLH1之间存在蛋白水平的相互作用，可导致基因的改变，进而影响表达蛋白的功能，这三种多态均增加了HNPCC发生危险［7］。

本研究采用了PCR-DNA Direct sequencing技术，针对大肠癌患者的外周血单个核细胞的DNA进行了检测，进一步深入研究hMSH2和hMLH1基因多态与大肠癌发病的相关性和危险性。研究结果表明，hMLH1-exon12 1151T→A突变阳性检出率，大肠癌组为12.20%，与对照组（6.10%）相比，无显著差异（P＞0.05）。在各年龄组间的Kendall等级相关分析结果无显著性差异（χ2近似于零，P＞0.05）。在hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变分析中，大肠癌组的突变阳性率为46.70%，显著高于对照组（33.33%）（P＜0.05）。进一步的危险性分析提示，携带hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变发生大肠癌的相对危险性（OR）为无基因突变组的1.75倍；在对照组中，若不携带基因突变，其肠癌发病率将降低42.9%（特异危险性百分比AR%）；若在人群中无hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变发生，则大肠癌的发病率将降低20%（人群特异危险性百分比PAR%）。在各年龄组间，hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变阳性率的Kendall等级相关分析无显著性差异（χ2＝0.139，P＞0.05）。

尽管这一结果与国外有关大肠肿瘤hMLH1基因和hMSH2基因变异的蛋白表达水平研究结果不完全一致，但结果提示，hMSH2基因突变不仅与HNPCC的发病有关，而且与一定比例散发性大肠癌有关，并且认为hMSH2基因是诱导细胞凋亡而导致肿瘤抑制的一个重要机制。因此，筛查hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突变，仍然可以作为大肠肿瘤筛查、早期诊断的参考指标。

［1］Miladinov-Mikov M，Lukic N，Petrovic T.Epidemiological characteristics of colorectal cancer in Vojvodina［A］.In：Riboli E，Lambert R，editors.Nutrition and Lifestyle：Opportunities for Cancer Prevention［C］.International Agency for Research on Cancer.Lyon：IARC Sci Publ，2002：156，547.

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［6］Hou ZF，Wang WZ，Yang SJ et al.Mutation of P53tumor suppressor gene in colorectal cancer and its relationship with histologic grade and Dukes’stage［J］.J N Bethune Univ Med，1999，25（2）：140.

［7］Hutter P，Wijnen J，Rey-Berthod C，et al.An MLH1haplotype is over-represented on chromosomes carrying an HNPCC predisposing mutation in MLH1［J］.J Med Genet，2002，39（5）：323.

Screening of susceptible gene hMLH1and hMSH2in Colorectal cancer

HOURui-zhi，ANZhi-guo，WEIJun，etal.（China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033，China）

ObjectiveTo explore the hMLH1，hMSH2gene polymorphisms and colorectal cancer risk.MethodsUsing large sample randomized controlled trials，hMLH1，hMSH2gene polymorphism of peripheral blood mononuclear cells DNA were screened by PCR and DNA direct sequencing.ResultshMLH1-exon12 1151T-＞A mutation in colorectal cancer group was 12.20%，there is no significant difference comparing with control group（6.10%）（P＞0.05）；hMSH2-exon1IVS1＋9C-＞G mutation（46.70%）was significantly higher than control group（33.33%）（P＜0.05）.But there is no significant difference in ages（P＞0.05）.Risk analysis shows that，the relative risk with hMSH2-exon1IVS1＋9CG mutations in colorectal cancer is 1.75times of control group.The incidence of colorectal cancer will be reduced by 42.9%if it do not carry the gene mutation，and be reduced by 20%in population.ConclusionhMSH2-exon1IVS1＋9C-＞G mutation can be used as the pathogenesis of colorectal cancer risk factors，and can be used as the testing index.

Colorectal cancer；polymorphism；hMSH2

1007－4287（2012）01－0049－03

吉林省科技发展计划项目（200705308，20090738）

＊通讯作者

R735.3＋4

A

2010－11－29）