纤维素酶辅助提取盾叶薯蓣中薯蓣皂苷的工艺优化研究

唐 俊 葛海涛 张云霞 杜 云

江苏黄河药业股份有限公司，江苏盐城224400

盾叶薯蓣又名黄姜、火头根，为被子植物门，单子叶植物纲，薯蓣科，薯蓣属多年生草本缠绕性植物，它是我国特有的甾体激素类药源植物。其根茎含有薯蓣皂苷（俗称皂素）、淀粉和纤维素，已被证实其中药效成份薯蓣皂苷具有增强性功能、抗衰老、治疗心血管疾病以及抑制癌细胞等功效，是合成各种避孕药和载体激素类药物的主要原料。薯蓣皂苷元提取工艺通常采用自然发酵酸水解法、分离法、酸水解法等，而这些方法的得率往往很低，且产生大量的酸水，造成严重的环境污染。

据宋发军[1]报道盾叶薯蓣中含纤维素达50%以上，因此，本试验拟采用纤维素酶法处理盾叶薯蓣中皂苷元，利用纤维素酶酶解可以破坏纤维素的β-D-葡萄糖苷联结键，从而破坏其细胞壁，在水解时能够最大限度地将薯蓣皂苷转化成薯蓣皂苷元，能够显著提高有效成分的提取收率。

响应面分析法（response surface method,RSM）[2]是一种有效的优化条件的方法，用于在加工过程中确定各因素及其交互作用对非独立变量的影响，其表述因素和响应值之间的关系最为精确，同时也是最经济的方式，对所选的实验参数可以较少的次数和较短的时间内进行全面研究，目前已广泛应用于各个领域。

本研究将主要考察纤维素酶辅助提取盾叶薯蓣中薯蓣皂苷的提取方法，以薯蓣皂苷元收率为评价指标，采用5因素3水平的响应面分析法优化得到最优提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

盾叶薯蓣药材（江苏黄河药业股份有限公司提供）；薯蓣皂苷元对照品（中国药品生物制品鉴定所提供）；纤维素酶（河南丰达生物科技有限公司，酶活力40 000 U/g）；甲醇（中国医药集团上海化学试剂公司，色谱纯）；石油醚（中国医药集团上海化学试剂公司，分析纯）。

1.2 主要仪器

电子天平（AG135，METTLER TOLEDO公司）；循环水式真空泵（SHZ-DⅡ，巩义市予华仪器厂），高效液相色谱（Waters 515 pump）；TGL-16B型台式高速离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；2487紫外检测器。

1.3 实验方法

1.3.1 提取工艺 称取一定量盾叶薯蓣原料，加入一定比例的水以及纤维素酶，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH值至一定范围，在40 ℃以上的水浴条件下搅拌提取一段时间后迅速升温至90～100 ℃，保温10 min，使酶灭活，纱布过滤得滤液，滤渣烘干后用石油醚回流提取8 h，热过滤，合并滤液静置至结晶完全，抽滤后滤饼烘干即得薯蓣皂苷元结晶。

工艺流程图如下：

1.3.2 薯蓣皂苷元提取工艺的考察 用中心组合设计法（central composite design,CCD）进行各影响因素的分析。数学模型：

考察因素（自变量）：

X1-盾叶薯蓣与水的料液比；X2-酶解pH值；X3-纤维素酶用量（U）；X4-酶解作用时间（h）；X5-酶解温度（℃）

考察指标（因变量）：

Y1-薯蓣皂苷元得率（%）

据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，采用五因素三水平的响应面分析方法。实验因素水平见表1。

表1 实验因素水平表

1.3.3 薯蓣皂苷元得率的测定方法 本研究采用反相高效液相色谱法测定薯蓣皂苷元含量。

色谱条件：色谱柱：岛津VP-ODS（150 mm×4.6 mm×5μm）；流动相为甲醇：水=95∶5（V/V）；流速：1.0 mL/min；UV检测波长为208 nm；进样量：10 μL；柱温为25 ℃。

标准品溶液制备：取薯蓣皂苷元对照品0.250 0 g，用甲醇超声溶解，并定容至100 mL，得2.50 g/L对照品溶液备用。

样品溶液制备：称取盾叶薯蓣20 g，按1.3.1提取方法进行提取，所得的薯蓣皂苷元结晶加入甲醇超声溶解，并定容至250 mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，所得滤液按上述色谱条件进行进样检测，结果代入标准曲线方程，得到薯蓣皂苷元含量。

薯蓣皂苷元得率为所得薯蓣皂苷元占盾叶薯蓣总量的百分数。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

精密吸取标准品溶液 0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，并分别定容至 10 mL，浓度分别为 0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g/L。分别经0.45 μm微孔滤膜过滤，所得滤液按上述色谱条件进行进样检测，并绘制标准曲线，薯蓣皂苷元对照品溶液色谱峰如图1所示。

图1 薯蓣皂苷元标准品色谱图

结果表明：薯蓣皂苷元在0.1～2.0 g/L之间具有良好的线性关系，拟合标准曲线，其回归方程为Y= 0.015 8X + 0.017，相关系数为r=0.998 9。

2.2 提取工艺考察实验结果及显著性分析（表2）

表2 中心组合试验设计结果

2.3 各因素对收率的影响分析

表3 对收率的方差分析表

方差分析结果表3显示：酶解pH（X2）与纤维素酶（U）用量（X3）对盾叶薯蓣皂苷元收率（Y1）影响统计显著（P值均小于0.005）。因此这两个因素对响应值起主导影响作用。笔者利用软件Ststistic 6.0分析得到拟合全变量二次回归方程，各变量的偏回归系数估计值及方差分析结果，得到拟合方程为：

Y1=0.997 422-0.004 44X1+0.182 364X2+0.297698X3+0.046 667X4-0.04X5-0.346 119X12+0.184 844X2

2-0.453 166X3

2-0.073 881X42-0.113 881X5

2+0.031 250X1X2+0.021 250X1X3+0.008 750X1X4-0.001 250X1X5+ 0.043 909X2X3+0.031 250X2X4+0.011 250X2X5-0.008 750X3X4-0.008 750X3X5+0.023 750X4X5

响应面是响应值对各实验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上形象的看出最佳参数与各参数之间的相互作用。借助软件Statistic根据回归方程以酶解pH（X4）和纤维素酶用量X3为因素，其他因素全部选择为水平2，绘出的拟合响应面曲面如图3。

由图3响应面可以看出随着纤维素酶用量（X3）的增加，收率（Y1）显著增加，在酶解pH值达到最大值的时候可得到收率的最值，而并不是在纤维素酶用量（X3）最大的时候。这是由于在一定条件下，酶浓度对酶的催化反应速度产生影响，当酶浓度较低时，酶活性中心被饱和，提取率随着酶浓度的增加而迅速增加，而后酶浓度继续增加时，反应速度增加率就比较小，当酶浓度增加至一定程度时，提取率达到一个限值，此时纵使再增加酶浓度时，反应速度增加缓慢甚至减小；同时在不同pH值的条件下，可能会引起纤维素酶活的降低或升高，从本实验结果来看，盾叶薯蓣提取薯蓣皂苷元的最适pH在5.0～6.0之间。

图3 响应面拟合Y1（X2，X4）

2.4 最优水平确定及验证试验

考虑到实验最终目的是要优化得到纤维素酶辅助提取盾叶薯蓣中薯蓣皂苷的提取方法，综合各种因素的相互作用，根据二次多项回归模型方程，利用利用软件Ststistic 6.0中数学模型及快速登高法优化出高提取率的工艺条件见表 4。

表4 最优工艺条件参数

换算成实际工艺参数为：盾叶薯蓣与水的料液比为1∶10；酶解pH值为5.75；酶解温度为54 ℃；酶解作用时间为2.5 h；纤维素酶用量10.8 U。根据所得到的提取工艺，笔者对盾叶薯蓣进行重新提取，平行3次，所得薯蓣皂苷元的收率平均为1.53%，远优于之前盾叶薯蓣的传统提取工艺方法。

3 结论

在纤维素酶酶解法提取盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的试验过程中，笔者利用中心组合设计实验法及Ststistic 6.0软件响应面分析法分析功能优化得到了明显提高薯蓣皂苷提取率的提取工艺条件，结果证明了本实验设计统计方法能快速有效的实现工艺条件优化，其优化后的条件效果较为理想，在薯蓣皂苷元生产研究领域具有良好的应用前景以及指导意义。

[1]宋发军.甾体药源植物薯蓣属植物中薯蓣皂苷元的研究及生产状况[J].天然产物研究与开发，2005，14（3）：89-92.

[2]惠尉，张东旭.响应面分析法优化盐酸丁螺环酮微球制备工艺研究[J].时珍国医国药 2008，19（9）：2268-2271.

[3]Muralidhar RV，Chirumamila RR.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon soures[J].Biochemical Engineering Journal，2001，9（1）：17.