硬骨鱼类MHCⅠ基因结构与抗病力关系探讨

贾震虎，夏 春

（1.山西师范大学生命科学院，山西 临汾 041004；2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193）

在经历了数亿年的演变与进化后，硬骨鱼类形成了具有种属特征的抗感染以及稳定自身的特异性免疫应答系统；而在其特异性免疫应答系统中，由于MHCⅠ（major histocompatibility complex classⅠ）型分子的主要功能是与病毒等内源性蛋白多肽结合，并提呈至限制性CD8＋T 细胞，促进杀伤性CD8＋T细胞的形成。在硬骨鱼类的免疫系统中发挥着重要作用，因而与动物疾病的抵抗力密切相关。最近，一些报道也证实了硬骨鱼类MHCⅠ与其对疾病的抗性与易感性密切相关，并决定对各种疫苗的免疫应答［1］。而硬骨鱼类为提升自身对疾病的抗性则应对病原对物种的毁灭，其生存策略是形成了具有种属特征的MHCⅠ基因结构。

1 多样的多肽结合区PBR（peptide-binding region）

人和哺乳动物MHCⅠ基因座的共同特征是高度多态、抗原肽结合位点保守以及表达于所有有核细胞表面。晶体学实验结果证明，人、鼠、猴、鸡MHCⅠ型分子均由α1和α2区形成两α螺旋组成PBR，其底部有6个小口袋，用于锚定CTL（cytotoxic T lymphocyte）表位，而且经典MHCⅠ的锚定氨基酸残基十分保守［2］。现有的研究表明，硬骨鱼类MHCⅠ型分子的结构和哺乳动物相似，硬骨鱼类经典的MHCⅠ型分子的 重链与位于不同染色体上的β2m微球蛋白基因编码的轻链非共价结合后，其中MHCⅠ型分子的 重链的胞外区中的α1和α2区域形成PBR，在内质网PBR结合抗原肽，形成三分子复合体；随后与CD4－CD8＋阳性细胞上TCR及其共受体结合、传导信号激活T细胞，引发机体的特异性CTL免疫应答［3］。CTL免疫应答在机体清除病毒感染以及抗肿瘤免疫过程中起着关键性的作用。因此，硬骨鱼类对病毒、寄生虫以及肿瘤是否产生特异性细胞免疫应答以及免疫应答的强弱本质上取决于其MHCⅠ－肽复合体能否与CTL细胞结合及其亲和力的大小。

硬骨鱼类MHCⅠ型分子结合抗原肽，引发机体的特异性CTL免疫应答揭示了其最富于多态的部分也集中于PBR。Persson等［4］采用PCR方法和Southern-blot的方法从一条大西洋鳕个体的脾脏cDNA文库中筛选出了17条不同的克隆，可以分成两类，序列差异主要在PBR，而α1变异并不大。Aoyagi等［5］在研究虹鳟MHCⅠ时获得大量高度多样性的序列但却都是来自同一个基因座，这些基因的PBR同样是高度变异的。由此可见PBR的多样性使硬骨鱼类产生不同的等位基因从而呈递不同的抗原多肽，抗原呈递的这种变异就可能在功能上导致抗病力的差异。

2 MHC I基因高度多态

2.1 不同个体具有多态性 MHCⅠ基因是已知最具多态性的基因，也是抗原呈递途径中的关键基因。MHCⅠ基因的多态性与抗病能力有重要的关系，每个个体中的多态性使得MHC能够结合和呈递不同抗原到T细胞中，从而影响T细胞识别。夏春等［6］在研究虹鳟不同品系MHCⅠ型基因的多态性时就指出MHCⅠ的这种多态性将有助于阐明品系间不同MHC等位基因抗病表现力的相关性。同时从草鱼cDNA文库中克隆了MHCⅠ基因（Ctid-MHCⅠ），并通过对12个个体MHCⅠ的克隆分析了其等位基因的多态性和三级结构，结果显示，MHCⅠ等位基因可分为六类Ctid-MHCⅠ2UA～UF），9型（A-I），但其三级结构和抗原多肽结合的关键性氨基酸十分保守。通过对草鱼MHCⅠ的序列分析，结合已知的软骨鱼、硬骨鱼、两栖类、鸟类、哺乳类和人MHCⅠ氨基酸序列，构建的分子系统树提示了我国大陆架上鱼类、两栖类、鸟类、哺乳动物和人的遗传距离与分枝年代［7］。

2.2 有数目不一的基因座 在庞大的硬骨鱼类的种间与种群内，经典MHCⅠ基因座发生过十分巨大的变异与演化，结果导致了目前等位基因座的不对称性与明显差异。

迄今为止，人、哺乳类、爬行类、两栖类、鸟类以及鱼类基因组测序表明，有颌脊椎动物均存在两个或两个以上的MHCⅠ基因座。Hashimoto等最早报道了鲤鱼MHCⅠ基因。随着鲨鱼、虹鳟、大西洋鲑、希腊鱼、斑马鱼、河鲀、鲶鱼、大西洋鳕、青鳉、草鱼等不同种属鱼类的MHCⅠ基因被相继克隆报道［8］。另外，河鲀、斑马鱼、青鳉、虹鳟、大西洋鲑全基因组测序工作已经完成或正在推进，欧美主要经济鱼类MHCⅠ的基因座数目与结构，以及等位基因多态性已十分清楚。Michalová等［9］采用染色体步移法揭示了斑马鱼MHCⅠ区长约450kb，包含至少19个基因座，其中包括3个MHCⅠ基因座（Dare-UDA，-UEA，-UFA），5个蛋白酶体亚单位β（PSMB8，-9A，-9C，-11，-12），2 个 TAPs（TAP2A，TAP2B）和1个TAP结合蛋白（TAPBP）。而在人和鼠中，PSMB8，TAP，TAPBP位于 MHCⅡ区。除此之外，斑马鱼还存在一个约150 kb的次要classⅠ区，包含两个 MHCⅠ基因座（Dare-UBA，-UCA）和至少其他5个基因座，它可能代表一个不同的MHCⅠ单倍体模型。

大西洋鲑有8个MHCⅠ基因座分别为（UCA，UDA，UEA，UFA，UGA，UHA，ULA和ZE），但是Miller等［10］发现新的大西洋鲑的 MHCⅠ基因的UBA基因，可以界定为MHCⅠα，与其他等位基因的氨基酸序列的同源性非常低，只有34%，与表达的基因座（UHA和ZE）无任何关系，由此断定UBA基因是目前发现的进化最为远古的MHCⅠ基因座。而Kjoglum等［11］的研究大西洋鲑 MHCⅠ和MHCⅡ的不同基因型之间可以进行联合作用，在抗病感染中发挥协同作用，说明了外界环境对MHC基因型的影响作用。不同种类的MHC基因座是不同的，但是同一种鱼类，其MHC基因座的数目也可能不同。Osterhout［12］在研究古比鱼时发现野生的和观赏的古比鱼的MHC基因等位基因的数目存在较大的差异，原因不能仅仅归结于饲养环境的不同，可能的原因还是由于基因插入、转置的结果。

3 具有干扰素刺激应答元件ISRE（ifn-stimulated response sequence）

干扰素（Interferon，IFN）本身没有直接杀伤病毒作用，需要诱导一系列抗病毒蛋白的表达才能建立宿主细胞的抗病毒状态。因而是一个重要的免疫调节因子；其调控依赖于基因在5＇端侧翼区有一段干扰素刺激应答元件（ISRE），该顺式作用序列是基因转录的增强子［13］。近来夏春等通过研究草鱼MHCⅠ基因组［14］，发现鱼和人以及哺乳动物经典MHCⅠ在启动子区域有共同的结构：调节转录区由4个保守区域组成，分别存在S-box、X1X2、EnhB（Y）结构和GAAA基序，以及ISRE基序。结果暗示了干扰素可上调MHCⅠ基因表达；并通过试验证明rCtid-IFN刺激后，MHCⅠ基因在主要免疫器官中的表达量明显增加，而头肾中的表达不受影响。这一结果与IFN刺激人细胞系和血淋巴细胞8～24h之后，可诱导其MHCⅠ出现表达高峰类似。从而证明了硬骨鱼IFN可在转录水平调节MHCⅠ的表达，从蛋白与分子水平证实了硬骨鱼类MHCⅠ的免疫生物学功能，即IFN调节MHCⅠ的表达这一生化途径也存在于进化位置更低端的硬骨鱼类［15］。同时也证实了硬骨鱼类MHCⅠ虽然结构上比较简单，但抗原呈递中关键基因以及多种免疫基因启动子调控元件的克隆，说明硬骨鱼类拥有与高等生物相似的抗原呈递途径和活化机制。

4 小结

硬骨鱼类在长期的进化过程中，则应对病原对物种的毁灭以及提升自身对疾病抗性的需要，拥有了与高等生物相似但又具有种属自身特征的MHCⅠ基因结构。

［1］Utke K H，Kock H，Schuetze S M，etal.Cellmediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus［J］.Dev Comp Immunol，2008，32：239-252.

［2］Koch M，Camp S，Collen T，etal.Structures of an MHC class I molecule from B21 chickens illustrate promiscuous peptide binding［J］.Immunity，2007，27：885-899.

［3］Purcell A W，Elliott T.Molecular machinations of the MHC-I peptide loading complex［J］.Curr Opin Immunol，2008，20：75-81.

［4］Persson A C，Stet R J.Characterization of MHC class I and beta（2）-microglobulin sequences in Atlantic cod reveals an unusually high number of expressed class I genes［J］.Immunogenetics，1999，50：49-59.

［5］Aoyagi K，Dijkstra J M，Xia C，etal.Classical MHC class I genes composed of highly divergent sequence lineages share a single locus in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）［J］.J Immunol，2002，168：260-273.

［6］Xia C，Kiryu I，Dijkstra J M，etal.Differences in MHC class I genes between strains of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）［J］.Fish Shellfish Immunol，2002，12：287-301.

［7］Yang T Y，Hao H F，Jia Z H，etal.Characterisation of grass carp（Ctenopharyngodon idellus）MHC class I domain lineages［J］.Fish Shellfish Immunol，2006，21（5）：583-591.

［8］Sambrook J，Figueroa G F，Beck S.A genome-wide survey of Major Histocompatibility Complex （MHC）genes and their paralogues in zebrafish［J］.BMC Genomics，2005，6：152-158.

［9］Michalova V，Murray B W，Sultmann H，etal.A contig map of the Mhc class I genomic region in the zebrafish reveals ancient synteny［J］.J Immunol，2000，164：5296-530

［10］Miller K M，Li S，Ming T J，etal.The salmonid MHC class I：more ancient loci uncovered［J］.Immunogenetics，2006，58（7）：571-589.

［11］Kjoglum S，Larsen S，Bakke H G，etal.How specific MHC class I and class II combinations affect disease resistance against infectious salmon anaemia in Atlantic salmon（Salmo salar）［J］.Fish Shellfish Immunol，2006，21（4）：431-441.

［12］van O C，Joyce D A，Cummings S M.Evolution of MHC class IIB in the genome of wild and ornamental guppies，Poecilia reticulata［J］.Heredity，2006，97（2）：111-118.

［13］Zou J，Tafalla C，Truckle J，etal.Identification of a second group of type I IFNs in fish sheds light on IFN evolution in vertebrates［J］.J Immunol，2007，179：3859-3871.

［14］Jia Z H，Ling C Y，Yang T Y，etal.Construction and charac-terization of grass carp（Ctenopharyngodon idellus）fosmid library［J］.Agricultural Sciences in China，2010，9（9）：1347-1352.

［15］Chen W H，Jia Z H，Zhang T，etal.MHC Class I presentation and regulation by IFN in bony fishdetermined by molecular analysis of the class I locus in grass carp［J］.J Immunol，2010，185：2209-2221.