作用于血液系统的蛇毒蛋白酶的研究进展

李红枝，刘玉超，唐松山

(广东药学院 基础学院 广东省重点生物活性实验室，广东 广州 510006)

作用于血液系统的蛇毒蛋白酶的研究进展

李红枝，刘玉超，唐松山＊

(广东药学院 基础学院 广东省重点生物活性实验室，广东 广州 510006)

蛇毒是蛇毒腺分泌的天然毒液，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其它小分子物质，它们参与蛇的捕食消化和防御功能。蛇毒中含有许多种影响血液系统功能的蛋白质或酶，因其显著的生物功能和药用活性，受到广泛关注。本文就对蛇毒中影响血液系统的丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶和5'-核苷酸酶等蛋白酶的最新研究进展进行了综述。

蛇毒;血液系统;丝氨酸蛋白酶;金属蛋白酶;磷脂酶A2;L-氨基酸氧化酶;5'-核苷酸酶

世界上大约有3 000种蛇，其中有600种是有毒的。这些毒蛇主要分布于四大家族:游蛇科(Colubridae)、眼镜蛇科(Elapidae)、蝰蛇科(Viperidae)和穴蛇科(Atractaspididae)。蛇毒中含有酶类和非酶类两种蛋白质，这些蛋白可以引起凝血，出血以及次生效应，例如低血容量性休克、器官损伤、诱导血栓形成或出血等。蛇毒中的蛋白酶、磷脂酶A2(snake venom phospholipase A2，sn-PLA2)、L-氨基酸氧化酶和 5'-核苷酸酶(5'-nucleotidases)都是影响血液凝固的酶类。蛇毒蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族或金属蛋白酶家族，能够从不同方面影响血液凝固和纤溶系统。本文对作用于血液系统的蛇毒蛋白酶的研究进展做一综述。

1 丝氨酸蛋白酶家族

蛇毒丝氨酸蛋白酶具有精氨酸酯酶活性和酰化活性，因在其催化部位共有丝氨酸残基而得名。这类酶的活性可以被丝氨酸蛋白酶抑制剂-二异丙基氟磷脂(DFP)或苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。蛇毒丝氨酸蛋白酶主要存在于蝰蛇科、眼镜蛇科和游蛇科的蛇毒中［1］，它们在蛋白质底物肽链的带正电荷氨基酸残基右侧水解。蛇毒丝氨酸蛋白酶具有一个典型的包含催化三联体His-Asp-Ser的胰蛋白酶折叠结构，该胰蛋白酶折叠结构有12个氨基酸残基组成，其中10个氨基酸残基由5对二硫键连接，剩余的2个半胱氨酸形成桥状。蛇毒丝氨酸蛋白酶作用于凝血或纤溶系统的多个环节，干扰凝血自稳机制，按其作用靶蛋白的不同，可分为蛇毒类凝血酶(Snake venom thrombin-like enzymes，SVTLE)、蛇毒纤溶酶、蛇毒凝血因子激活剂和蛇毒纤溶酶原激活剂(Snake venom plasminogen activators，sn-PA)等。

1．1 SVTLE

SVTLE与凝血酶的序列相似性超过33%，在体外都能使纤维蛋白原凝结［2］。有些SVTLE，如来自 Bothrops marajoensis蛇毒的TLBm酶，可以引起血小板凝结。凝血酶的抑制剂，如抗凝血酶-Ⅲ、肝素和水蛭素通常不会对SVTLE产生抑制作用。根据从纤维蛋白原中释放血纤肽的不同，可以将SVTLE分为3种类型:FP-A类型(释放A肽)、FP-B类型(释放B肽)和FP-AB类型(释放A和B肽)。大多数SVTLE释放血纤肽A。FP-B类型的SVTLE释放血纤肽B的速度要快得多，需要长时间保温才能引起纤维蛋白原凝结;FPAB类型的SVTLE水解纤维蛋白原的方式与凝血酶相同，它既可以释放血纤肽A又可以释放血纤肽B。近5年来得到的SVTLE都属于FP-A类型，它们是BJ-48(来源于Bothrops jararacussu蛇毒)，Leucurobin(来源于 Bothrops leucurus蛇毒)和Agacutin(来源于尖吻蝮蛇蛇毒)。

SVTLE通常不会激活凝血因子Ⅱ和因子ⅩⅢ，所产生的纤维蛋白聚合物分子间以氢键头尾连接，成水溶性［3］。一些SVTLE对纤原水解能力较弱，在血液中形成长时间纤维蛋白单体，一旦有伤口，在伤口处加速血液凝固，即止血作用，这类SVTLE被发展成临床注射止血剂，如注射用蛇毒血凝酶(来自Bothrops jararaca和Bothrops atrox蛇毒)、邦停(来自东北白眉蝮蛇蛇毒)［4］和苏灵(来自尖吻蝮蛇蛇毒)［5］;有些酶对纤原的水解能力极强，在短时间内大量耗竭纤维蛋白原形成可溶性纤维蛋白，这些纤维蛋白的形成或者纤原的快速降低，激活了血液中的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，后者激活纤溶酶原形成纤溶酶，水解纤维蛋白，出现抗凝溶栓效果，这类SVTLE被发展成临床溶栓药，如东菱克栓酶(来自Gloydius shedaoensis 和 Gloydius ussuriensis 蛇毒)［6］、降纤酶(来自白眉蝮蛇和尖吻蝮蛇蛇毒)［7］、安克洛酶(来自 Calloselasma rhodostoma 蛇毒)［8］和 Crotalase(来自 Crotalus adamanteus蛇毒)［9］。可溶性纤维蛋白对体内的纤溶酶敏感，易降解为无活性的小肽，在血管内可迅速的被网状内皮系统及肾脏清除。这就是SVTLE用于治疗出血或血栓类疾病的作用机理。

1．2 蛇毒纤溶酶

蛇毒纤溶酶作用于纤维蛋白原的α和β链。各种蛇毒纤溶酶对α和β链的专一性及裂解速度不一致，在最近的报道中，Harobin(来源于 Lapemis hardwicki i蛇毒)、BpSP-Ⅰ(来源于Bothrops pauloensis蛇毒)和 TLBm既作用于α链又作用β链。Harobin在延长作用时间的情况下，还可以水解纤维蛋白原的γ链。重组蛋白Albofibrase(来源于Trimeresurus albolabris蛇毒)和 Bhalternin(来源于 Bothrops alternatus蛇毒)只作用于α链。BJ-48只作用β链。许多蛇毒纤溶酶既可同时具有溶解纤维蛋白原和纤维蛋白的活性。

1．3 蛇毒凝血因子激活剂

蛇毒蛋白对不同凝血因子起特异性激活作用。蛇毒凝血酶原(凝血因子Ⅱ)激活剂有金属蛋白酶类和丝氨酸蛋白酶类之分［10］。根据作用机理和辅助因子的需求的不同，可分为A、B、C和D等4类，其中A和B类属于金属蛋白酶类，C和D类属于丝氨酸蛋白酶类，它们仅存在于澳大利亚眼镜蛇(Australian elapids)蛇毒中。C类的活性需要Ca2+和带负电荷的活性磷脂，而D类的活性需要钙离子、磷脂和凝血因子Va。所有蛇毒凝血酶原激活剂都是裂解凝血酶原，将凝血酶原转化为凝血酶。在结构和功能方面，蛇毒凝血酶原激活剂与一些凝血因子相类似［11］，C类类似于凝血因子Va或Xa复合物，如Pseutarin C(来源于Pseudonaja textilis蛇毒)，其中一个催化亚基与凝血因子Xa结构相似，另一个与凝血因子Va结构相似。Pseutarin C的重组研究表明，蛇毒凝血因子Va结构对C蛋白的裂解具有抑制作用［12］。D类在结构和功能方面都与凝血因子Xa相类似，如来源于Tropidechis carinatus蛇毒的Trocarin D。

除了凝血因子Ⅱ激活剂外，还有凝血因子Ⅹ、Ⅶ和Ⅴ激活剂［13］。Ⅹ因子激活剂是一个分子质量约59 kD的蛋白质，由一条重链和一条轻链通过二硫键连接而成。迄今为止，只发现了极少的凝血因子Ⅹ激活剂，例如，在眼镜王蛇和金环蛇的蛇毒中发现了Ⅹ因子激活剂，它们都是单链糖蛋白，分子质量分别为62和70 kD，具有Ca2+依赖性。在无Ca2+存在时不能使血液凝固，在有Ca2+存在时能显著缩短凝血时间。迄今为止，还没有分离出单一蛇毒Ⅶ因子激活剂。凝血因子Ⅴ的3个内源性活化位点分别为 Arg709、Arg1018和Arg1545，其中最关键的位点是Arg1545。来源于Vipera lebetina蛇毒的VLFVA和来源于Vipera russelli蛇毒的RVV-V就是通过裂解Arg1545对凝血因子Ⅴ进行激活。这类蛇毒酶可作为实验的工具酶，在科研工作中参与活化不同凝血因子。

1．4 sn-PA

sn-PA主要存在于蝰亚科和蝮亚科蛇毒中［14］。迄今为止，发现了3种sn-PA，它们是TSV-PA(来源于Trimeresurus stejnegeri蛇毒)、Haly-Pat(来源于Agkistrodon halys brevicaudus蛇毒)和LV-PA(来源于Lachesis muta muta蛇毒)。sn-PA的分子质量在30～35 kD，活性位点由组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸残基组成，与人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)只有21% ～23%的同源性，两者在结构上存在较大差异［15］:sn-PA有200～300氨基酸残基和蛋白酶区结构，而人t-PA有527氨基酸残基组成，除具有蛋白酶区外，还有指形区、表皮生长因子区、Kring2区和KHRR区结构域，后四个局部结构域参与体内构件分子之间的相互作用。sn-PA具有的单一蛋白酶功能结构，必将在溶栓药物的研究中伴有重要的地位。

2 金属蛋白酶家族

蛇毒金属蛋白酶(Snake venom metalloproteases，SVMP)是以Zn2+为活性中心的金属蛋白酶，主要分布在蝰蛇科和响尾蛇科等［16］。SVMP普遍具有引起出血、水肿和炎症等生物学活性。Bjarnason和Fox等根据所含结构域数和分子质量大小，将SVMP分为PⅠ～Ⅳ4种类型［17］。这类蛋白酶主要用作出血和炎症研究的阳性试剂，如溶血和出血毒试验等。

2．1 PⅠ型 SVMP

PⅠ型SVMP分子质量较低，它具有非出血或出血活性，可以降解纤维蛋白原，但不降解血纤维蛋白。出血性PⅠ型SVMP能降低血液中血纤维蛋白原的含量，在破坏基底膜引起出血后，降低血液凝固能力，增强出血效应［18］。目前已从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分离出3种PⅠ型出血毒素:Acutolysin A、Acutolysin B和 Acutolysin C。

2．2 PⅡ型 SVMP

PⅡ型SVMP包含金属蛋白酶结构域和类去整合素或去整合素样结构域，它通过金属蛋白酶的水解作用产生了去整合素蛋白［19］。去整合素是从蛇毒中分离出来的一类小肽，含有47～84个氨基酸残基，它们大都含有RGD三肽序列，通过与血小板膜表面整合素受体αⅡbβ3相互作用抑制血小板聚集。去整合素和类去整合素都富含高度保守的半胱氨酸结构。从美洲西部菱斑响尾蛇(Crotalus atrox)蛇毒中获取的Atrolysin E和来自于蝮蛇中的 Bilitoxin-1为 PⅡ型SVMP。

2．3 PⅢ型 SVMP

PⅢ型SVMP为高分子质量出血性金属蛋白酶，包含富含半胱氨酸结构域和类去整合素样结构域，这两个结构域位于蛋白水解酶结构域之后［20］。与PⅡ型不同，PⅢ型SVMP不含RGD结构域，其类去整合素样结构域多数为Ser-Glu-Cys-Asp(SECD)。PⅢ型一般比PⅠ型具有更强的出血性，推测其富含半胱氨酸结构域和类去整合素样结构域具有血小板聚集和增强SVMP的活性中起重要作用。大多数PⅢ型SVMP能够抑制胶原蛋白和ADP诱导的血小板聚集。

2．4 PⅣ型 SVMP

PⅣ型SVMP除了包含蛋白水解酶结构域、半胱氨酸结构域和类去整合素样结构域外，还含有一个通过二硫键与上述三个结构域连接的类C型凝集素结构域［21］，来自Exhis carinatus蛇毒的RVV-X和carinactivase-1属于此类。

3 sn-PLA2

sn-PLA2催化磷酸甘油三酯的第二位酯键水解，生成脂肪酸和溶血磷脂［22］。由于蛋白酶活性的高低与能否结合Ca2+息息相关，所以Lys49型sn-PLA2仅有较低的酶活性或者没有酶活性。这类酶只作为实验室研究的工具酶，特异性水解磷脂。

4 L-氨基酸氧化酶

蛇毒L-氨基酸氧化酶包括FAD结合结构域、底物结合结构域和螺旋结构域。一个底物结合结构域和螺旋结构域形成一个底物结合通道［23］。L-氨基酸氧化酶具有多种生物学功能，如诱导血管内皮细胞凋亡、抑制或诱导血小板聚集、细胞毒性、抗菌活性、抗肿瘤活性以及杀寄生虫等。目前推测，L-氨基酸氧化酶对血小板聚集的两种不同效果，是由于酶活性的高低不同导致了反应性血小板聚集所致。

5 5'-核苷酸酶

5'-核苷酸酶为单链糖蛋白，分子质量约74 kD，EDTA和Zn2+对该酶活性有抑制作用［24］。不同种属的蛇毒5'-核苷酸酶性质不同，例如Fe3+离子不能完全抑制白唇竹叶青蛇毒的5'-核苷酸酶活性，但可以完全抑制竹叶青蛇蛇毒5'-核苷酸酶的活性。蛇毒5'-核苷酸酶对ADP、胶原及花生四烯酸诱导的人血小板聚集有抑制作用，其抑制作用是由于该酶能把AMP和ADP水解成腺苷和磷酸所致。

6 展望

蛇毒是巨大的天然药库，有多个成份已经发展成药品。随着分子生物学的发展，越来越多的蛇毒蛋白的基因得到分离、鉴定和表达。本文综述的研究进展对进一步阐明蛇毒蛋白酶的结构和功能的关系及生物技术新药研发打下基础。

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Study on the snake venom proteases affecting the blood system

LI Hong-zhi，LIU Yu-chao，TANG Song-shan*
(Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)

R973

A

1005-1678(2012)06-0917-04

2012-04-20

广东省中山市科技项目(编号:2009H015)

李红枝，女，教授，硕士生导师，主要从事细胞遗传毒理学研究，Email:lihong581110@163．com;刘玉超，男，共同第一作者，硕士研究生;*．唐松山，男，通信作者，教授，硕士生导师，主要从事蛋白生化药学研究，Email:songstang@gmail．com．