自体造血干细胞移植与1型糖尿病

景华

1型糖尿病是由自身反应性T淋巴细胞介导,针对胰腺内分泌β细胞的器官特异性的自身免疫性疾病[1]。几乎所有1型糖尿病患者都需要应用外源性胰岛素注射来控制血糖，患者不但遭受胰岛素注射所带来的不便和痛苦，又不能完全控制血糖稳定并避免远期并发症的发生。胰岛细胞移植为解决上述难题提供了新途径[2-3]，但是由于胰腺供体不足及移植排斥等原因，限制了胰岛细胞移植的广泛开展[4]。造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是所有的免疫细胞(包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞)的祖细胞，具有极高的自我更新、多向分化和重建造血的潜能，CD34抗原是HSC标志性抗原，CD34+细胞（表达CD34抗原的细胞）是非均质性的细胞群，其中既含有HSC也存在不同分化阶段的各系造血祖细胞，并随着造血细胞逐渐成熟，CD34+的表达量逐渐减少，直至消失。正常人骨髓低密度单个核细胞中CD34+细胞约占1.5﹪（1.0﹪～ 3.0﹪），脐带血为 0.2﹪～0.5﹪，外周血 CD34+细胞约为骨髓的1/10，CD34+细胞群被血液学家称为最佳的移植物。根据以上3种不同的HSC来源，相应的在临床上被称为骨髓HSC移植、外周血HSC移植和脐带血HSC移植。下面将HSC移植治疗1型糖尿病从基础研究和临床应用进行综述。

一、基础研究

干细胞具有多向分化的潜能，特定微环境控制着干细胞的更新和分化。随着对干细胞的研究的深入，发现其不仅可以分化为同一胚层来源的细胞，而且可以分化为不同胚层来源的细胞，即干细胞具有可塑性。随着HSC研究的兴起,作为一类具有多向分化潜能的细胞,已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源[5]。

（一）HSC向胰岛β细胞分化

Oh等[6]研究表明骨髓细胞体外培养可以诱导分化为胰岛素分泌细胞，经扩增后移植可以纠正糖尿病鼠的高血糖，效果可以持续90 d。Tang等[7]将鼠骨髓源HSC在烟碱和exendin环境下培养1周,用抗胰岛素和抗C肽抗体标记,发现10﹪～ 20﹪的骨髓源HSC标记抗胰岛素抗体和C肽抗体,说明骨髓HSC真正合成和分泌了胰岛素和C肽。Lanus等[8]认为骨髓源HSC可以分化为有活性的胰岛β细胞,他建立了一个小鼠模型，将标记有荧光蛋白的骨髓干细胞移植到小鼠的胰腺。行骨髓移植后大约1～2个月的受体小鼠的胰岛内发现了骨髓来源的胰岛细胞。这些细胞表达胰腺β细胞所特有的遗传标志物，并检测到受体母鼠体内来自于雄性供体小鼠的荧光细胞的Y染色体呈阳性。当给予生理性葡萄糖刺激时，骨髓来源细胞分泌胰岛素，并重现了胰岛β细胞钙离子的细胞内流。

Hess等[9]建立了一个链脲霉素致糖尿病的小鼠模型，链脲霉素致糖尿病小鼠给予致死剂量的放射线照射，再移植入标记有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的供体骨髓细胞。行骨髓移植17 d后的小鼠血糖正常，有正常的胰岛素分泌，42 d生存率达75﹪～ 85﹪；而对照组小鼠持续高血糖，且死亡率增加，42 d生存率仅为0﹪～ 50﹪。试验小鼠表现出伴随血糖升高胰岛素分泌增强的现象。在随后的试验步骤中，研究者通过检测着色的血小板内皮细胞粘附分子-1（Plateletendothelial Cell Adhesion Molecule，PECAM-1）内皮细胞蛋白，发现骨髓来源细胞在胰腺中已分化成为内皮细胞。Wang等[10]将GFP转基因小鼠骨髓细胞给新生期非肥胖性糖尿病（non-obese diabetic，NOD）小鼠,2个月后发现NOD小鼠40﹪的胰腺导管细胞起源于供者骨髓细胞,并在胰腺中发现了表达GFP的胰岛细胞。综合以上试验认为骨髓细胞进入已被破坏的胰岛内并分化成为内皮细胞，并刺激胰腺前体细胞增殖，使这些前体细胞最终分化成为胰腺内分泌细胞。

骨髓干细胞主要通过直接的转分化和间接分化、移植诱导微嵌合状态，形成免疫耐受、细胞融合以及参与细胞的修复和再生等方式治疗糖尿病患者。转分化是一种定向分化细胞改变基因表达模式而转变为另一种完全不同的细胞类型，而骨髓干细胞可直接转分化为胰腺内分泌细胞[11]。Steptoe等[12]通过将骨髓细胞或HSC移植到NOD小鼠，发现骨髓移植能够诱导糖尿病鼠的耐受，减轻胰岛细胞的免疫损伤，防止糖尿病发展。

（二）HSC促进内源性胰岛β细胞的修复与再生

研究表明，骨髓移植后，可以参与成体组织的再生，如神经细胞、肾脏、肌肉、肝脏、皮肤、胰腺、小肠及结肠，骨髓中的循环内皮祖细胞参与成体的血管形成，包括生理更新和损伤修复[13]。Kojima等[14]研究表明糖尿病鼠胰腺外许多组织含有胰岛素表达阳性细胞，包括胸腺、骨髓、脂肪组织、脾脏和肝脏，这些胰岛素表达阳性细胞来源于骨髓。Mathews等[11]研究则表明骨髓来源的内皮祖细胞可迁移至小鼠受损伤的胰岛处，这些细胞具有促血管形成作用，参与胰岛β细胞的再生。Burt等[15]研究表明对于糖尿病患者来说，仅输入足够数量的胰岛细胞并不能达到治疗效果，胰腺中胰岛β细胞仍会遭到自身免疫系统的攻击而破坏，导致胰岛病的产生，而来源于骨髓的HSC具有可以诱导对自身抗原的免疫耐受及胰岛细胞再生的双重功能，这一研究也说明HSC能够诱导免疫耐受，调节T细胞的阳性选择及阴性选择，改善糖尿病实验对象的免疫功能，促进胰岛细胞再生。Rachdi等[16]研究表明小鼠 胰岛中有10﹪～ 20﹪的胰岛素阳性细胞可以检测出HSC的KIT标志物，而且，研究显示表达c-kit干细胞标志物（可作为干细胞表面标志物）的骨髓细胞可使高血糖水平降低，而c-kit表达阴性的细胞却无此功能。说明HSC参与胰岛细胞的再生。Banerjee等[17]认为骨髓HSC移植有助于胰岛再生。Hasegawa等[18]在实验中发现在新生胰岛周围有较多的CD45+细胞，认为糖尿病小鼠骨髓移植后，骨髓细胞首先归巢，随后被动员到受损胰腺组织，进而促进胰岛细胞的再生。Gao等[19]发现骨髓移植可以促使糖尿病小鼠胰岛及胰管再生，特别是CD34+细胞促进胰岛组织的修复及再生。

二、临床研究

目前糖尿病的治疗临床上主要用胰岛素替代治疗和血糖控制，并没有彻底的根治方案，而HSC能够诱导出成熟的胰岛β细胞，分化出胰岛结构，同时又避免特异的免疫反应则可以达到临床的治愈，解决糖尿病患者的痛苦。骨髓HSC移植和外周血HSC移植是临床常用的方法，由于外周血干细胞采集简单、方便、安全和有效，且外周血HSC与骨髓移植相比，造血和免疫恢复快，因而可以减少住院日，减少抗生素的使用和输血依赖，降低医疗费用，所以在临床上的应用越来越广泛。

（一）国外研究

Voltarelli等[20]研究报道，采用大剂量免疫抑制剂后进行自体非清髓性HSC移植治疗15例新诊断1型糖尿病患者。具体方法：采用环磷酰胺抑制淋巴细胞同时联合集落刺激因子动员骨髓后，自外周血采集自体HSC，再予大剂量环磷酰胺联合抗淋巴细胞球蛋白预处理，最后将采集的自体HSC静脉回输。结果在7～36个月的随访中，14例患者可达到并维持不同时间的胰岛素非依赖，这是首例高剂量免疫抑制联合自体HSC移植治疗人类1型糖尿病的报告。该研究小组后来增加8名病人，结果：在7～58个月的随访时间（平均29.8个月，中位数，30个月），20例没有酮症酸中毒患者脱离胰岛素[21]。其中12例保持了平均31个月，（范围14～52个月），8例复发，并恢复使用低剂量胰岛素（0.1～0.3 IU/kg）。在连续脱离胰岛素的病人，糖化血红蛋白水平低于7.0﹪，平均的C肽曲线下面积大幅上升，取得了良好的血糖控制大多数患者脱离胰岛素。

（二）国内研究

早在2004年张传仓等[22]即用环磷酰胺及粒细胞集落刺激因子动员的方法动员骨髓干细胞到外周血中，修复损伤的胰腺β细胞，结果该患者胰岛素需用量减少64﹪，空腹C肽水平恢复正常。可能与大剂量环磷酰胺免疫抑制与外周血HSC迁徙到胰腺组织中，在胰腺组织微环境的诱导下分化增殖为胰腺β细胞有关。沈山梅等[23]采用自体非清髓性HSC移植治疗1型糖尿病1例，该患者移植后第27天停止注射胰岛素，随诊15个月，病情稳定，血糖控制良好，糖化血红蛋白稳定于7.0﹪以下。初步显示出一定的临床有效性。景华等[24]报道，采用T淋巴系统清除和自体HSC免疫重建治疗1型糖尿病2例，具体方法：单用粒细胞集落刺激因子动员、采集，环孢素A及ATG预处理后，回输自体HSC。结果2例患儿分别于回输后第14，22天停用胰岛素，复查糖化血红蛋白及C肽恢复正常，谷氨酸脱羧酶抗体滴度明显降低。到目前停用胰岛素分别为18个月、16个月。初步显示自体非清髓性HSC移植治疗1型糖尿病的临床有效性，仍需大样本量前瞻性研究，以进一步评估此疗法的远期疗效与安全性。

（三）作用机制

自体HSC移植治疗1型糖尿病的作用机制尚不清楚。可能与以下机制有关：（1）免疫抑制可抑制自身免疫反应，阻止胰岛炎性反应的破坏作用；（2）免疫抑制可诱导移植免疫耐受，阻止自身反应性糖尿病的发生；（3）移植的HSC促进受体胰岛β细胞再生与修复[25]。

三、挑战及展望

1型糖尿病是医学难题,目前没有根治办法。HSC是目前研究最广泛、应用最成熟的成体干细胞，不仅来源丰富，易采集，而且能抑制自身排斥反应，拥有广泛的应用前景。其基础研究证实HSC可定向分化为胰岛β细胞,促进内源性胰岛β细胞的修复与再生,临床研究结果取得了令人鼓舞的治疗效果,为糖尿病患者点燃了新的希望，也为研究人员提供了新的突破口。毋庸置疑，HSC已成为目前治疗1型糖尿病的最佳种子细胞之一，虽然目前存在一些问题，如需解决免疫排斥，以及如何选择合适的移植方式、时间、部位和数量等，找到最佳的搭配组合，提高治疗效果等等，但随着HSC及其相关研究的深入和技术的提高，相信在未来的数年内，HSC在1型糖尿病中的应用将有新的突破。

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