肾癌干细胞的研究现状

朱贤鑫 孙星慧 谭建明

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的发病率在全身恶性肿瘤中占2﹪～ 3﹪左右，在泌尿系所有肿瘤中是最致命的。流行病学资料显示，超过40﹪的RCC患者死于该病，而前列腺癌和膀胱癌的病死率仅为20﹪。RCC的基本治疗是根治性肾切除术，对放射治疗和化疗都不敏感[1-2]。且RCC易复发、转移及预后差，并具有多药耐药性[3]。目前认为RCC组织中也存在肿瘤干细胞。2001年Reya等[4]提出了肿瘤干细胞学说，1年后A1-Awqati等[5]就提出了RCC干细胞的假设，近年国内外对RCC干细胞进行大量的研究，并关注RCC干细胞的靶向治疗，希望找到并明确RCC干细胞的表面标志物及其微环境，通过其表面标志物和微环境来研发一种治疗RCC及控制其复发和转移的药物，来延长RCC患者的生存时间。

一、干细胞的定义

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化增殖潜能的原始细胞，根据干细胞的来源及分化潜能的不同分为：(1)全能干细胞，如胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)，具有向机体各类细胞分化的潜能；(2)多能干细胞，如成体干细胞(adult stem cells, ASCs)，能分化成除了胚胎以外的任何一种细胞；(3)单能干细胞，如造血干细胞，能分化为特定功能的细胞和特定组织的细胞。干细胞都具有永生性(longevity)、多向分化潜能(pluripotency)及自我更新 (self-renewal)3 大特性[4、6]。

二、肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)

肿瘤是一种单克隆细胞起源，经无限增殖形成的恶性疾病。2001年Reya等[4]发现恶性肿瘤浸润性生长、局部复发和远处转移的特点与干细胞基本特征十分相似，继而推测肿瘤是干细胞增殖分化失调而产生的异常组织，在干细胞的理论基础上提出了CSCs学说。2006年美国癌症研究协会(American Association for Cancer Research, AACR)CSCs研究小组一致将CSCs定义为：存在于肿瘤组织中的具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞[7]。

CSCs的几个特点：（1）具有无限的自我更新能力，能产生与上一代细胞完全相同的子代细胞；（2）具有分化潜能，即可以产生不同分化程度的子代肿瘤细胞，用于解释肿瘤细胞的异质性；（3）高致瘤性，实验证明CSCs比非CSCs具有更高的成瘤潜能，很少量的CSCs在体外动物培养中即可形成肿瘤；（4）特异性的表面标志，CSCs具有其特异性的表面标志，如急性髓系白血病(acme myeloid leukemia, AML) 的表面标志为 CD34+CD38-，神经CSCs的表面标志为CD133+；（5）具有耐药性，CSCs膜上表达的ABC家族膜转运蛋白可运输并排出代谢产物、药物及毒性物质等多种物质，使化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用减弱，是肿瘤治疗失败的重要原因[8]。CSCs的研究最早源于AML的CSCs。Bonnet等[9]成功分离出人类AML干细胞。并确定其表面标志为CD34+CD38-，这一研究首次证实了CSCs的存在。随后，人们发现CSCs不仅仅存在于AML，同样也存在实体瘤中。2003年Al-najj等[10]首先利用NOD/SCID小鼠模型，从乳腺癌细胞中分离鉴定出具有干细胞类似生物学特性的细胞群体。这是首次在实体瘤中发现CSCs的存在。之后在脑肿瘤[11]、胰腺癌[12]、前列腺肿瘤[13]等实体瘤中也证实了CSCs的存在。对以上这些癌症的研究表明，恶性肿瘤的增殖、复发、转移及对放化疗不敏感性与CSCs有密切的关系。

CSCs与干细胞之间存在着很多相似的特点[14]：(1)两者均具有自我更新和无限增殖能力，增殖的同时可诱导血管生成；(2)均有较高的端粒酶活性以及扩增的端粒重复序列；(3)均通过两种分裂的形式来保持其细胞特性；(4)干细胞的迁移和CSCs的转移都有一定的组织和器官特异性，且二者皆受特异性化学因子及其受体的调节；(5)二者有许多相似的生长调控机制，如Wnt，Sh2，Notch途径；(6)自我更新越频繁的组织，干细胞自我更新率越快，肿瘤的发生率越高。

三、RCC干细胞及其表面标志

1989年Bander等[15]应用单克隆抗体探针进一步研究RCC细胞起源，发现在RCC中，部分细胞表型和正常胎儿近端肾小管祖细胞表型一致，表达相同的抗原。Gomella等[16]发现部分RCC细胞和胚胎时期的肾脏细胞均产生大量转化生长因子-α，而正常成熟肾脏细胞则停止产生转化生长因子-α。根据以上结果可推断，RCC细胞中部分细胞的特性与胚胎时期肾脏部分细胞极为相似，提示了RCC干细胞的存在可能。RCC主要由具有致癌性能的RCC干细胞和无致癌性能的其他细胞组成，RCC干细胞很可能是RCC的种子细胞，可能来源于近端肾小管祖细胞等肾脏干细胞。随后人们对RCC干细胞的分离鉴定进行了大量的研究。

所有肿瘤细胞都有独特的标记存在于表面，利用肿瘤细胞表面的蛋白标志物及特异的抗体，采用免疫磁珠等技术就能将表型特异的肿瘤细胞分离出来[17]。通常用的方法有表型标记筛选法、侧亚群细胞（side population, SP）分选法和微球体培养分离CSCs[18]。SP分选法又称为Hoechst33342染料排斥法，Hoechst33342是一种DNA增补性染料，能结合到DNA的AT丰富系列的小沟处，干细胞及CSCs因带有ABC转运蛋白而能将染料泵出而表现为染料暗淡的特征而被分离出来，所分选出来的染色暗淡的细胞被称为SP细胞。已经证实，在非附着培养条件下，以多细胞球或者球形细胞聚集体方式形成集落的能力是许多具有自我更新能力细胞的一种特点。这些细胞球可以被打散并且多次传代，仍然保留形成球体的能力。体外球体形成试验已被用于研究乳腺CSCs[19]和脑CSCs[20]。利用这些方法，2005年Florek等[21]从RCC中发现RCC干细胞的存在。潘鹏等[22]通过无血清培养的方法提取了RCC干细胞。基于目前分选方法的限制，研究热点仍在如何确定RCC干细胞的表面标志物。主要是Oct-4、CD133+、ABCG2及BMI-1基因等与RCC干细胞之间的关系。

（一）Oct-4

Oct-4是由POU5Fl基因编码产生的[23]，定位于染色体6p21.3，其编码的蛋白是一种POU转录因子，属于POU转录因子家族的一员。Oct-4在全能性胚胎细胞中表达，被认为是ESCs保持自我更新、维持未分化状态的主要调控因子。Oct-4通常被认为是ESCs的标记物，是一种在ESCs和精原细胞中表达的转录因子，并且是调控和维持其多能性所必须的，它在肿瘤的发生增殖及分化过程中扮演重要的角色。Oct-4作为一种ESCs转录因子，它在泌尿系肿瘤中的表达提示在这些肿瘤中存在CSCs。Looijenga等[24]对包括100种以上不同类型肿瘤及3600例癌的多肿瘤组织微阵列分析表明Oct-4在RCC、精原细胞瘤/无性细胞瘤、胚胎性癌及它们的原位癌前体／性腺母细胞瘤中呈阳性表达。朱朝辉等[25]对27例RCC标本采用IHC和RT-PCR法进行检测，发现Oct-4在绝大多数(25/27)的RCC标本中呈阳性表达，正常肾皮质组织和癌旁组织中未检测到Oct-4表达。Oct-4在RCC组织中的表达，说明了RCC中存在干细胞性质的肿瘤细胞，而是否为RCC干细胞还需要更多的证据支持，更多的研究从RCC中分离RCC干细胞并描述它的特点，阐明Oct-4在RCC发生中的作用。

（二）CD133+

CD133+是一种分子量为120kDa具有5个跨膜区的蛋白，是一种早期抗原。最初该蛋白被命名为AC133+，属于Prominin家族成员。2000年，在英国举行的第七届国际人类白细胞分化抗原研讨会上被正式命名为CD133+。现在CD133+分子已经成为造血干/祖细胞（haematopoietic stem and progenitor cell, HSPC）的特征性表面标志。CD133+分子存在于正常干细胞的表面，是干细胞特征性的分子，可富集在包括ESCs在内的不同干细胞[26]。目前CD133+在实体瘤CSCs的研究中日益显示出其重要作用。脑肿瘤细胞表面CD133+可作为筛选CSCs的特征性标志[27]；CD133+能和其他表面标志共同作为筛选前列腺癌干细胞的标志[28]。然而CD133+是否也存在于肾脏及RCC中有待研究， Florek等[21]从RCC中发现存在CD133+具有CSCs特性的细胞。翟羽佳等[29]及潘鹏等[22]也证实RCC中存CDl33+具有CSCs特性的细胞，而在正常肾组织细胞未测出有CD133+的表达。大量研究证实CD133+可能作为RCC干细胞的表面标志。

（三）ABCG2

ABCG2基因定位于人类染色体的4q22-q23，大小为67171bp，其基因的表达产物是有655个氨基酸组成的膜转运蛋白，具有6个跨膜区和1个核结合区[30]。它作为一种跨膜转运蛋白，能把许多药物排出细胞外，因此在肿瘤耐药中起着至关重要的作用[31]。ABCG2是首先在乳腺癌中发现的一种参与肿瘤细胞耐药的物质，是位于细胞膜上的耐药相关半转运蛋白，与P糖蛋白和多耐药相关蛋白同属ABC转运蛋白超家族，最早被定义为多耐药转运蛋白[32]，也称为Bcrpl。杨保旺等[33]证实ABCG2在RCC组织中表达较高，其可能参加了RCC的发生和发展。RCC的一个显著特点就是对化疗极不敏感，而侧群干细胞的标志物ABCG2的主要作用恰恰就是把包括化疗药物在内的药物泵出细胞外，使化疗药物不能起作用，使肿瘤耐药。由此可以推测侧群干细胞标记物ABCG2在RCC的耐药中可能起着关键的作用。所以ABCG2很有可能也是RCC干细胞的表面标志物。

（四）BMI-1基因

BMI-1基因是干细胞在各种不同组织中生存必不可少的基因，其具有促进干细胞自我更新，抑制细胞周期蛋白激酶抑制基因p16Ink4a表达的功能。Al-Awqati等[5]于2002年已经提出了RCC干细胞的假设，并认为RCC干细胞与BMI-1表达阳性的血液系统及实体CSCs有相似性，但是关于这一假设暂无确切证据。2006年，Lju等[34]提出了BMI-1的表达与CSCs的调节有关，因此有理由根据BMI-1的表达鉴别RCC干细胞。Kozakowski等[35]研究显示BMI-1更像是一个判断肿瘤分化程度的标记物。至此关于BMI-1与RCC干细胞的关系尚无定论。

四、以CSCs为靶点的靶向治疗

CSCs有很强的自我更新能力，且处于静止状态、有效的DNA修复、高表达多药耐药型膜转运蛋白以及缺氧微环境等特性使其能够抵抗常规的放射和化学治疗。那么彻底治愈肿瘤唯一有效的方法就要针对CSCs群。

目前肿瘤靶向治疗的方法有：(1)以CSCs的表面标记物为靶点，通过基因表达分析寻找CSCs特异表达抗原，首先在血液系统疾病中取得突破性进展，使用抗一种CSCs标志物CD44的抗体，清除了接种AML的免疫缺陷小鼠体内的AML干细胞[36]；(2)促进CSCs分化，在实体瘤上也有可能应用分化诱导治疗的方法，人们发现在体外骨形成蛋白4(bone morphogenic protein, BMP4)能降低丝裂原的增殖作用，减少CD133+细胞数量，使CD133+细胞丧失在体内形成肿瘤的能力，体内应用BMP4可缩小接种瘤体积，延长生存期，这提BMP4可以通过诱导CSCs分化发挥抑制肿瘤的作用[37]；（3）针对CSCs自我更新及静止状态，如BMI-1基因为维持CSCs自我更新的信号通路，这也使得BMI-1基因可能成为去除CSCs的靶点；（4） CSCs生存所需的微环境，以CSCs生存所需的微环境为靶点成为肿瘤治疗的又一种选择，已经发现以脑肿瘤起始细胞的血管微环境为靶点的治疗可以减少肿瘤起始细胞的数量，终止肿瘤生长。然而，即使将这些通路作为靶点仍可能是不够的，一种理想的药物应当选择性地浓集于CSCs而非正常干细胞。如果缺乏选择性，疗效将可能会受限于全身毒性。

五、结论

针对RCC对放、化疗均不敏感且术后易复发、转移，预后不佳的特性，RCC干细胞概念的提出为RCC发生、发展、复发和转移的机制提供了全新的视角。RCC治疗的模式可能将从单纯杀伤肿瘤细胞群向靶向治疗RCC干细胞转变。研究RCC干细胞与肾脏正常细胞蛋白或基因表达的差异、信号转导通路的差异、表面标志的差异，选择性地对这些细胞进行干预，可为RCC的治疗开辟新的途径。RCC的异质性决定了肿瘤组织中仅存在小部分的CSCs对化疗、免疫治疗产生持续的内在耐药性。RCC靶向治疗的关键是以RCC干细胞为治疗靶点。而RCC干细胞可能表达表面标志物CD133+、ABCG2等，但目前暂未找到特异性的靶向治疗标志物，针对RCC干细胞自我增殖信号传导通路和细胞周期基因或蛋白的阻滞剂可能给RCC的治疗带来新的希望。RCC干细胞的研究很重要，研究其发生、发展规律并加以消灭，是根治肿瘤及防止其复发、转移的一条重要途径。RCC干细胞的研究目前还处于起步阶段。当前的研究还需解决如下问题：寻找RCC干细胞更精确而特异的表型；分离RCC干细胞而不伤及正常干细胞；研究RCC干细胞的微环境，明确RCC干细胞自我更新，不对称分裂和维持周围微环境的分子机制；筛选RCC干细胞靶向治疗的药物。这些问题的解决将极大提高RCC诊治水平。

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