Ang-1和Ang-2在肝细胞癌组织中的表达及其与血管生成的关系

韩 斌，庞志刚，刘 超，陈文超，陆 旭，王广田

(郑州大学第二附属医院普外科，河南郑州450014)

肝细胞癌(HCC)是典型的多血供、高恶性、易转移的恶性肿瘤，血管生成是其发生发展和转移的必要环节，多种血管生成因子参与其肿瘤血管生成调节［1］。近年来发现血管生成素(Ang)及其受体与多种肿瘤血管生成有关［2－3］，但其与 HCC的关系鲜有报道。本研究采用免疫组化法检测36例肝细胞癌组织中Ang-1和Ang-2的表达，并以CD34标记检测HCC组织的微血管密度(MVD)，探讨Ang与HCC病理特征和血管生成的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2004年至2006年我院手术切除并经病理证实的HCC存档蜡块标本36例，其中30例带有癌旁组织，所有入组病例临床资料均完整。男性30例，女性6例，年龄30～67岁，平均年龄48.8岁。临床病理特征:AFP阳性28例，AFP阴性8例;HBsAg阳性30例，HBsAg阴性6例;肿瘤直径≥5 cm 17例，＜5 cm 19例;Edmondson病理分级，Ⅰ级7例，Ⅱ级13例，Ⅲ级8例，Ⅳ级8例;镜下血管侵犯24例，无血管侵犯12例。结合影像学资料及手术所见，门脉主干有癌栓、肝门部淋巴结转移、同一肝叶主癌灶周围瘤数目≥2个或有多个卫星结节判定为高侵袭转移，共14例;余为低侵袭转移，共22例。5例外伤性肝破裂切除肝组织标本为健康对照，均为男性，年龄18～45岁，均无乙肝病史，HBsAg阴性。

1.2 主要试剂 兔抗人Ang-1单克隆抗体、兔抗人Ang-2单克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司，所有试剂均为浓缩型，工作浓度1∶100。

1.3 检测方法及结果判定标准 严格按照试剂盒说明书进行染色，以PBS替代一抗作阴性对照。Ang-1和Ang-2结果判断:细胞胞浆内和(或)胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞，结果评分参照文献［4］:染色强度分级，细胞基本无着色为0分、浅黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分;染色范围分级，阳性细胞比率0% ～5%为0分、6% ～25%为1分、26% ～50%为2分、50%以上为3分;将每张切片2项得分相乘，≥4分为阳性，＜4分为阴性。MVD的判定:先用100倍光镜扫视整个切片，寻找高血管密度区，再在3个400倍视野下计数CD34阳性细胞，取其平均值为结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0进行数据处理，计数资料比较用χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料比较用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Ang-1和Ang-2的表达 5例正常肝组织标本中，Ang-1阳性者3例，Ang-2均为阴性。HCC组织及癌旁组织中Ang-1和Ang-2均有不同程度的表达，阳性细胞主要是肿瘤细胞，癌旁部分肝细胞也有阳性表达，均为胞浆着色，其中Ang-2的阳性表达情况见图1。Ang-1在HCC组织和癌旁组织中的阳性率分别为44.44%(16/36)和 53.33%(16/30)，差异无统计学意义(χ2=0.518，P ＞0.05);HCC 组织与正常肝组织中Ang-1的表达差异亦无统计学意义(χ2=0.427，P＞0.05)。Ang-2在HCC组织和癌旁组织中的阳性率分别为 83.33%(30/36)和 33.33%(10/30)，差异有统计学意义(χ2=17.135，P ＜0.05)。

2.2 MVD的检测结果 36例HCC组织的平均MVD为22.56 ±9.38，Ang-1 阳性者为 21.08 ±11.26，阴性者为23.24 ±8.02，差异无统计学意义(t=0.754，P ＞0.05);Ang-2 阳性者为 28.48 ± 10.36，阴性者为14.22 ±11.02，差异有统计学意义(t=4.359，P ＜0.01)。HCC组织中MVD情况见图2。

2.3 Ang-1和Ang-2与HCC不同临床病理特征的关系 Ang-2表达与血管侵犯、侵袭转移程度有关(P＜0.05)，而与其他临床病理学特征无关(P＞0.05)。Ang-1表达与各临床病理学特征无关(P＞0.05)。见表1。

3 讨论

Ang是由血管内皮分泌的血管源性生长因子，是酪胺酸激酶受体Tie-2的配体，Ang家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4共4个成员，其中Ang-1和Ang-2是最有效的血管新生调节因子。Ang-1广泛表达于胚胎和成人，在人体内，Ang-1主要作用是通过促进内皮细胞与周围细胞的黏附从而促进并维护已形成血管的完整性。Ang-2在人类和小鼠体内，选择性表达于卵巢、子宫和胎盘，主要作用是降低细胞与基质和细胞与细胞之间的联系，同时Ang-2通过与Ang-1竞争性结合Tie-2从而阻断Ang-1的作用［5］。

本研究发现HCC组织过表达Ang-2，其阳性率明显高于癌旁组织，正常肝组织则无表达，且Ang-2表达阳性者MVD明显升高，由此推测Ang-2与HCC肿瘤血管生成有关。而Ang-1在正常肝组织、HCC组织、癌旁组织中均有阳性表达，阳性率差异无统计学意义，Ang-1表达阳性者肿瘤MVD无明显升高，说明Ang-1可能是正常存在的血管生成因子，与新生血管的稳定和成熟有关，与HCC肿瘤血管生成无关。有研究［6］认为过表达的Ang-2诱导血管退化发生，当血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平较高时，Ang-2竞争抑制Ang-1效应，血管结构松解，基底膜和周围细胞对血管形成的限制减弱，内皮细胞对VEGF的敏感性增加，并导致新的毛细血管形成，肿瘤血管壁保持稀薄而有较高的渗漏性的特点，使肿瘤细胞得以实现转移。本研究发现Ang-2与肿瘤血管侵犯、侵袭转移程度有关，也支持这一观点。

有研究［7］发现Ang-2与HCC的肿瘤大小、病理分级等有关，本研究未能得出类似结论，这可能与样本量及研究方法不同有关。另外肿瘤血管生成又是一个复杂的生理过程，血管生成因子在其中起不同的作用，组织微环境也有不同的影响，缺氧等微环境可调节各种血管生长因子的分泌［8］。HCC组织中可能存在Ang-2与Ang-1比例的失调、Ang-2与VEGF的协同作用，尚需进一步研究阐明。

综上所述，作者认为HCC组织中Ang-2高表达，且与肿瘤血管生成有关，检测Ang-2有助于判断肿瘤侵袭转移能力，但不能反映恶性程度。

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