我国结核病血清学检测试剂调查结果简析

李丽莉 杨蕾 陈保文 都伟欣 卢锦标 白东亭 王国治

2011年7月20日，WHO公布的一项政策建议中指出：使用目前市面上商业性血液（血清学）检测手段诊断活动性结核病，常常导致误诊和不当治疗，进而损害公众健康。WHO敦促各国采用其推荐的准确的微生物或分子检测方法，禁止使用不准确的和未经批准的血清学检测方法［1］。该报告中还称：大量证据表明，与WHO推荐的检测方法相比，血清学检测产生大量假阳性或假阴性的错误结果［1］。

WHO公布的“关于活动性结核病检测手段”的政策建议，引起国家食品药品监督管理局（SFDA）以及SFDA相关部门的高度重视，2012年4月16日，SFDA发布了《关于进一步加强结核病血液检测试剂监管有关事宜的通知》（食药监办械［2012］48号），要求各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局按照通知要求对行政区域内有关结核病血液检测试剂的注册审评情况开展检查，试图通过对国内生产结核病诊断血清学制品的企业进行一次背景调查，分析目前国内结核病血清学检测试剂在生产过程质量控制和在临床评价中存在的问题及解决问题的方法。

一、我国目前结核病血清学检测试剂的使用情况分析

（一）我国结核病血清学检测试剂现状

在我国结核病临床实验室检测技术中，血清学检测是结核病辅助诊断的重要诊断试剂之一。市场上销售的结核病血清学诊断试剂有近百家，经国家食品药品监督管理局批准的国产诊断制品抗体检测试剂盒29个，其中经国家级批准的26个，省级批准的3个；进口制品1个。抗原检测试剂盒3个，其中省级批准的1个。大多数未经批准的结核病血清学诊断试剂游离于国家监管范围之外，值得引起国家有关部门及人员的关注与重视。

（二）结核病血清学诊断试剂生产企业背景调查情况介绍

本次调研根据国家食品药品监督管理局的通知要求，对行政区域内有关结核病血清学诊断试剂的注册审评情况开展检查，并组织行政区域内有关生产企业按照要求填报相关资料。调查资料的内容主要包括试剂盒背景资料，试剂盒成品检测，试剂盒检测参考品制备与标化，参考品使用情况及临床研究等方面。通过对各生产企业报送的资料进行分析，共收回调查问卷29份。我国目前结核病血清学诊断制品的品种与近3年的数量见表1。由于无法掌握未经批准的结核病血清学诊断试剂的非法销售情况，表1结果并不能代表国内实际销售状况。

表1 我国结核病血清学诊断试剂近3年产量分析

二、结核病血清学诊断试剂存在的问题和建议

（一）阳性参考品的选择

多数企业在阳性参考品选择时通常只选择菌阳患者抗体强阳性血清，如果试剂某批次质量出现问题，敏感度偏低时，若阳性参考品中全部使用强阳性血清，所有阳性参考品反应均呈阳性，则无法反映该试剂的真实敏感度，如标准品中有弱阳性血清的反应可能呈阴性，提示试剂敏感度可能存在问题。因此，血清学抗体检测试剂在质量控制中需要强、中、弱三种不同效价的血清用于敏感度的质量控制。同理，在试剂制备过程出现问题，可能产生假阳性时，如果阴性参考血清都选择本底极低的样品，可能无法检出，因此阴性参考品应含有临界阴性参考血清［2］。

（二）参考品的标化

为获得阳性与阴性不同效价的血清，获得血清后应先进行初筛，再用不同的方法学对血清进行效价标定，确定血清的效价，从中选择不同反应强度的样本，作为阳性或阴性参考品。但多数企业未进行细致的效价标化，通常以试剂盒筛选后就作为检测参考品。

同时，标准品的建立应有规范的操作细则，至少样品采集、检测与标化的过程中所有的实验操作均需先制定标准操作方法（standard operating procedure，SOP），再严格遵循SOP进行操作，并有对应的原始记录。目前，从已收到的资料来看，多数企业存在不足之处。

（三）参考品的制备

结核病体外诊断试剂参考品通常由阳性参考品、阴性参考品、最低检出量或最低检出限参考品和精密性或重复性参考品组成，用来控制试剂盒的敏感度、特异度、检出限和精密度等。但部分试剂厂家仅有阳性与阴性检测参考品［3］。

由于参考品用于体外诊断试剂质量控制，所以参考物质原料的选择取决于诊断试剂的预期用途。原料应与试剂盒的使用要求相一致或尽可能接近，这样可以消除方法基体效应引入的系统误差［2］，阳性参考品应包括痰菌阴性和痰菌阳性患者的血清，但个别企业仅采用采血站筛选的抗体阳性血清作为阳性参考品。

（四）参考品的稳定性

参考物质的均一性和稳定性：均一性可保证一批原料所制备的参考品均匀一致，即在不同空间检测结果的一致性和可比性；稳定性可使一批参考品长期分发使用，为企业或科研院所提供用于质量评价的参考品，保证在不同时间检测结果的一致性和可比性。稳定性考察一般需要观察在不同温度下放置不同时间，或经过反复冻融后，观察效价降低的情况。通过测定不同温度，不同冻融次数时特征活性的降低速率，从而确定贮存的适宜温度和时间，或反复冻融的次数。

（五）参考品制备与检测的安全性

血液（抗体、抗原和γ－干扰素）检测试剂盒的参考物质主要来源于感染者或疑似感染者的血液样本，另外，对于以人为来源的生物材料作为参考品原料或辅料，因其具有传染性，一定要注意实验室安全性［4］。

三、临床研究方面存在的问题与建议

（一）敏感度与特异度虚高

WHO评估结果显示，市售不同厂家的血液（血清学）诊断试剂的敏感度和特异度变化很大，敏感度变化范围为0%～100%，特异度变化范围为31%～100%［1］。根据收集的各企业临床资料显示：我国血液诊断试剂的敏感度平均值为80%左右，高于70%的占79%；特异度平均值为92%，高于90%的占95%。我国试剂调查结果与WHO的评估结果相比，我国试剂敏感度和特异度变化范围较小，而且变化范围相对集中。根据多年来我国结核病血清学抗体检测试剂质量评价的经验，目前的血清学抗体检测试剂，由于抗原种类和检测方法的原因，敏感度和特异度不可能同时达到很高的水平。事实上，该类产品若要达到高的敏感度，就必然会牺牲一定的特异度；特异度高，则必然以牺牲一部分敏感度为前提。但在此次调查中发现，为数不少的产品临床研究得到的敏感度和特异度均超过了90%（敏感度和特异度均在90%以上的产品比例为26%），超出了笔者对该方法学的认识，这些数据的真实性存在疑问，其产生的原因可能是临床研究与数据处理不够严谨，造成统计结果的偏差。因为提交资料的厂家均未提供详细的临床研究资料，所以还需进行进一步的调研。

（二）临床评价仅采用与同类制品进行比较评价的缺陷

部分企业根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》［5］，“已有同品种批准上市”产品的临床研究可采用已批准上市、质量较好的产品作为对比试剂，进行对比试验研究。只用两种同类试剂进行比较，两种方法的检测结果不一致率可能较低。但若将血清学结果与金标准进行比较，则可能会出现两种血清学检测结果均与金标准结果不一致率高的现象。即只用同类制品进行对比试验，无法体现临床阳性检出的真实情况［4］。

实际《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》中对“新诊断试剂产品”和“已有同品种批准上市”产品的临床研究的研究对象选择的规定原则相同，即：“研究对象应包括两组：一组是用金标准确定为有某种疾病的患者组，另一组是用金标准证实无该病的患者或正常人群，作为对照组”。根据这一要求，临床研究无论采取哪种方式进行，都要求收集所有入选者临床诊断的数据。

（三）临床研究的规范性

对此次调查收集到的临床研究进行分析发现，多数未规范进行临床研究，不能随机入选客观评价，数据经处理修改痕迹明显，这是导致临床研究的特异度与敏感度不真实的主要因素。因此，应建立规范的评价方法，临床研究内容与过程应尽可能与试剂临床使用一致，建议：（1）疑似结核病患者随机入组，依据《肺结核诊断标准（WS288－2008）》［7］将入选者分为结核病患者组（临床诊断患者与确诊患者）计算敏感度，非结核病对照组计算特异度［7］。（2）细菌学实验室检查阳性检出结果分析。结核病患者组检出结果分析：培养阳性样本的阳性总检出率分析包括：痰涂片和培养均为阳性（涂阳培阳），以及痰涂片阴性和培养阳性（涂阴培阳），所有阳性样本合起来（涂阳培阳、涂阴培阳样本）计算阳性检出率分析。培养阴性样本的阴性总检出率分析包括：痰涂片和培养均为阴性（涂阴培阴），以及痰涂片阳性和培养阴性（涂阳培阴），所有阴性样本（涂阴培阴、涂阳培阴）合起来计算阴性检出率分析。（3）与同类制品检测结果比较分析。必要时可与同类制品进行符合率比较，二者不一致时依据《肺结核诊断标准（WS288－2008）》［7］要求的评价标准（或其他适宜方法或试剂）判断各样本检测结果的准确性。

四、小结

（1）血清学检测试剂不能作为结核病确诊方法，但是可作为结核病的辅助诊断手段，我国结核病菌阴患者占70%以上［8］，结核病血清学诊断试剂作为菌阴肺结核的辅助诊断手段之一依然有存在必要。（2）试剂盒质量应严格控制，进一步完善产品质量控制，对质量不好的产品，应进行整改。（3）客观的临床评价是质量考核的重要依据，建议制定结核病血清学诊断试剂临床评价指南，在有可能的情况下，对上市产品进行临床评估，择优推广。（4）对于非法销售的产品，因其质量无法控制，应予以取缔。

［1］World Health Organization.World Health Organization（2011）policy statement：commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis.Geneva：WHO，2011.

［2］中国生物制品标准化委员会.中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）.北京：化学工业出版社，2000.

［3］陈保文，都伟欣，王国治，等.结核分枝杆菌抗体检测试剂生产质量控制与临床研究概述.中国防痨杂志，2012，34（8）：546－549.

［4］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京：中国教育出版社，2006：8－45.

［5］中华人民共和国国家食品药品监督管理局.体外诊断试剂临床研究技术指导原则.北京：中华人民共和国国家食品药品监督管理局，2007：3.

［6］中华人民共和国国家食品药品监督管理局.体外诊断试剂注册管理办法（试行）.北京：中华人民共和国国家食品药品监督管理局，2007：2.

［7］中华人民共和国卫生部.WS288－2008肺结核诊断标准.北京：人民卫生出版社，2008：2－3.

［8］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2012，34（8）：485－508.