磷酸化细胞外信号调节激酶1/2和基质金属蛋白酶-9在宫颈鳞状细胞癌癌变过程中的表达及相关性

安风仙，王 晓，刘 雯，高彦丽，马金龙，，徐兴欣，陈世明，杨 敏

1山东大学附属省立医院病理科，济南 250021

2山东大学医学院病理学研究所，济南 250012

3山东大学附属省立医院生殖医学中心山东省生殖医学重点实验室，济南 250021

4山东大学齐鲁医院病理科，济南 250012

宫颈癌是威胁女性健康的杀手之一，是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率居第二位［1］。现已证实，人乳头瘤病毒 (huamn papilloma virus，HPV)是宫颈癌发生发展的重要启动因素，然而越来越多的证据表明，HPV致癌蛋白仅能导致宫颈细胞的永生化，仅有HPV的感染也不能导致宫颈癌细胞的恶性转化，宫颈癌的发生发展是集环境、生物因素和遗传基因为一体的，是多种因素共同作用的结果。这一过程中，HPV的感染及感染后启动的一系列癌基因激活、抑癌基因失活、细胞信号传导通路的异常调节，最终改变了细胞的侵袭转移能力，导致宫颈癌发生。然而目前人们对于宫颈癌发生发展过程中信号传导通路的改变尚不十分清楚，这一瓶颈也制约着宫颈病变的临床病理诊断工作。丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)是细胞内重要的信号传导系统，而细胞外信号调节激酶 (extracellular regulated kinase，ERK)是该系统主要的和经典的通路，可被多种生长因子、细胞因子以磷酸化的形式激活，成为磷酸化细胞外信号调节激酶(p-extracellular regulated kinase，P-ERK1/2)，参与调节细胞周期及促进细胞的增殖与分化，在肿瘤细胞的发生发展中发挥一定作用。此外，肿瘤细胞发生侵袭和转移，首先要降解细胞外基质，基质金属蛋白激酶 (matrix metalloproteinase，MMP)是由肿瘤细胞和基质产生的蛋白水解酶，在肿瘤细胞局部浸润转移中起关键作用。本研究采用免疫组织化学技术PV-9000法，检测了P-ERK1/2和MMP-9在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变 (cervical intraepithelial neoplasia，CIN)、宫颈鳞癌中的表达，探讨了其在宫颈鳞癌发生发展过程中的作用。

材料和方法

标本来源 2009年1月至2010年12月由山东大学齐鲁医院病理科收集的石蜡包埋宫颈组织标本共133例，其中宫颈鳞58例 (宫颈鳞癌Ⅰ期19例，宫颈鳞癌Ⅱ～Ⅲ期39例)，CIN 45例，慢性宫颈炎30例。所有病例均由病理科确诊，所有患者在手术前均未接受放化疗，而且均无其他疾病。

主要试剂 浓缩型鼠抗人P-EK1/2单克隆抗体、MMP-9即用型工作液、PV-9000法免疫组织化学试剂盒和DAB显色液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

P-EK1/2和MMP-9表达的检测 取收集的所有石蜡标本按4 μm厚连续切片，按照PV-9000二步法进行，常规石蜡切片经二甲苯脱蜡、酒精水化后，微波抗原修复，3%H2O2封闭内源性过氧化酶，滴加鼠抗人P-ERK1/2单克隆抗体 (工作浓度1∶100)、MMP-9即用型工作液，4℃孵育过夜。二抗按照PV-9000试剂盒说明书进行。显微镜下控制DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。阴性对照使用PBS代替一抗。

结果判定标准 阳性染色呈棕黄色颗粒或团块状，P-ERK1/2阳性定位于细胞质和 (或)细胞核，MMP-9阳性染色在细胞浆内。选择具有代表性的两个高倍镜视野，400倍光镜下计数100个肿瘤细胞。根据染色程度和染色细胞百分率进行评分:基本不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;着色细胞占计数细胞的百分率≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，≥51%为3分。将每张切片评价着色程度分与平均着色细胞百分率得分各自相乘为其最后得分:≤1分为阴性(－)，2～3分为 (+)，4～6分为 (++)， ＞6分为 (+++)。弱阳性表达指 (+)，强阳性表达指≥ (++)［2］。

统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件包进行χ2检验，相关性检验采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

P-ERK1/2和MMP-9在各组中的表达情况 在慢性宫颈炎中无着色 (图1)，在CIN中呈浅黄色-棕黄色 (图2)，在宫颈鳞癌组织中呈棕黄色-棕褐色(图3)。P-ERK1/2和MMP-9在慢性宫颈炎、CIN及宫颈鳞癌组织中的阳性率分别为0和0、28.9%和24.4%、及77.6%和65.5%，3组间差异均有统计学意义 (χ2=54.393，P=0.003;χ2=40.968，P=0.005)。

图1 P-ERK1/2(A)和MMP-9(B)在慢性宫颈炎中的表达 (PV-9000，×400)Fig 1 Expressions of P-ERK1/2(A)and MMP-9(B)in chronic cervicitis(PV-9000， ×400)

图2 P-ERK1/2(A)和MMP-9(B)在宫颈上皮内瘤变中的表达 (PV-9000，×400)Fig 2 Expression of P-ERK1/2(A)and MMP-9(B)in cervical intraepithelial neoplasia(PV-9000， ×400)

图3 P-ERK1/2(A)和MMP-9(B)在宫颈鳞癌中的表达 (PV-9000，×400)Fig 3 Expression of P-ERK1/2(A)and MMP-9(B)in cervical squamous cell carcinoma(PV-9000， ×400)

P-ERK1/2和MMP-9在宫颈鳞癌中表达的影响因素 在宫颈鳞癌患者中，P-ERK1/2和MMP-9在≤40岁组中的阳性率分别为73.3%和66.7%，与＞40岁组的82.1%(P=2.34)和64.3%(P=1.05)差异无统计学意义;在临床Ⅱ～Ⅲ期组的阳性率分别97.4%和73.4%，明显高于Ⅰ期的36.8%(P=0.015)和47.4%(P=0.002);在G3组的阳性率分别为86.5%和73.0%，明显高于G1～G2组的61.9%(P=0.013)和52.4%(P=0.017);在有淋巴结转移组的阳性率分别为90.2%和73.2%，明显高于无淋巴结转移组的47.1% (P=0.017)和47.1%(P=0.021);肿瘤直径＞4cm组的阳性率分别为81.4%和76.7%，明显高于≤4cm组的66.7%(P=0.008)和33.3%(P=0.004)。

宫颈鳞癌组织中P-ERK1/2和MMP-9的相关性 P-ERK1/2与MMP-9在宫颈鳞癌组织中的阳性表达呈正相关 (χ2=8.955，P=0.006)。

讨 论

MAPK是细胞内的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，包含8个亚家族［3］。其中，ERK是其重要的亚家族之一。现已证实，ERK的活化需首先经过磷酸化后转变为P-ERK1/2，激活后的ERK随即转入细胞核内，在细胞生长、发育、分裂、死亡及恶性转化等过程中发挥主要作用［4］。MAPK-ERK途径的激活在胃癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展中扮演了重要的角色。

宫颈癌的发病与HPV的感染密切相关，宫颈上皮感染HPV后，HPV的致癌蛋白E6、E7可以持续表达，从而推动宫颈病变的发展。现已证实，HPV16 E6蛋白可以介导ERK1/2信号传导通路，增强正常宫颈上皮的癌变倾向［5］。研究发现，ERK1/2信号传导通路参与了Ras基因突变引发的宫颈癌细胞增殖，磷酸化MAPK/ERK1/2随着宫颈肿瘤向宫颈浸润癌的进展，表达逐渐增强［6-7］。本研究检测了P-ERK1/2和MMP-9在慢性宫颈炎、CIN和宫颈鳞癌组织中的表达，结果显示P-ERK1/2在慢性宫颈炎中无表达，在CIN呈弱阳性表达，在宫颈鳞癌组织中呈阳性表达，差异有统计学意义。P-ERK1/2在宫颈鳞癌的表达与患者年龄无关，与肿瘤的临床分期、组织学分级、有无淋巴结转移及肿瘤大小有关，提示P-ERK1/2信号传导通路的激活在慢性宫颈炎—CIN—宫颈癌恶变的演变过程中可能起一定促进作用，其激活可能促进了宫颈鳞癌的浸润及其淋巴结转移。总之，本研究中P-ERK1/2表达水平与宫颈病变程度有着良好的契合，但因本研究病例数较少，其能否作为一种诊断宫颈病变的辅助分子标志，仍需进一步研究。

肿瘤细胞的发生转移首先要降解细胞外基质，MMP是降解细胞外基质的重要酶类，该酶是锌离子依赖的内肽酶，其大小各异，底物不尽相同，都有信号肽、前肽和催化区等结构域，几乎能降解细胞外基质的所有成分［8］。有研究认为，MMP-9的表达是宫颈癌发生的早期事件［9］。本研究结果显示，从慢性宫颈炎到CIN到宫颈鳞癌组织，MMP-9的阳性率显著性增高，MMP-9在宫颈鳞癌的表达与患者年龄无关，与肿瘤的临床分期、组织学分级、有无淋巴结转移以及肿瘤大小有关，提示MMP-9的过表达可能促进宫颈鳞癌的浸润及其淋巴结转移。

以往研究证实，活化的ERK1/2即P-ERK1/2可通过磷酸化抗凋亡分子Bcl-2、激活转录因子及干扰TRAIL而达到抗凋亡作用，最终促进肿瘤细胞生长，活化的ERK(P-ERK1/2)还可以增加MMP-2和MMP-9的表达，促进细胞侵袭［5］。然而，该结论多依赖于细胞学水平的研究，组织学中研究甚少。本研究结果显示，P-ERK1/2、MMP-9在慢性宫颈炎、CIN和宫颈鳞癌组织中的表达成正相关，进一步佐证了ERK信号途径与MMP-9的表达调控关系。

目前，宫颈癌和CIN的主要诊断方法为宫颈细胞学涂片法、阴道镜检查和活组织检查等，其中，细胞学检查是应用最广泛的方法，但其依赖于主观、形态学的方法，有可能存在与组织病理学诊断差异的问题，而某些客观的分子标志物可以清楚区分真正的癌变细胞，从分子生物学水平客观评估细胞病变级别，有较高临床诊断价值。现有宫颈病变的诊断分子标志物有高危型 HPV相关标志［10］、P16 INK4a［11］和 Ki-67［12-13］等，这些分子标志物并不完善，并且单纯一种或两种分子标志物的检查并不能给出准确的诊断结果，所以仍需发展更多更有参考价值的分子标志物来作为鉴别诊断CIN的病变级别及CINⅢ和宫颈癌的辅助手段。本研究结果初步显示，P-ERK1/2和MMP-9可能作为临床评估宫颈鳞癌发生发展的诊断指标，但二者在宫颈鳞癌侵袭转移中的调控作用及其机制、二者之间的相互作用及其机制仍有待于进一步研究和明确。

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