小麦麸皮结构层中抗氧化物质的研究

陈中伟，廉文蕾，吴保承，杨春霞，王 莉，3，陈正行，3，*

(1.江南大学食品学院，江苏无锡214122;2.江苏省江大绿康生物工程技术有限公司，江苏无锡214028;3.粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122)

大量的流行病学研究表明:增加全谷物食品的摄入能有效降低心脑血管病、II 型糖尿病等慢性病的发病率，能很好地与果蔬中的抗氧化成分互补，是美国农业部推荐的人类膳食结构“My plate”中重要的组成部分［1-2］。麦麸是全谷食品的重要的组成，含有丰富的膳食纤维、蛋白质、矿物质和B 族维生素，营养价值很高，是我国重要的农副产品。小麦麸皮由多个结构层构成，可大致分为外皮层、中间层和糊粉层［3］。不同解剖结构中含有的抗氧化成份含量不同，主要包括肉桂酸系物质，如阿魏酸，香豆酸，咖啡酸等;没食子酸同类物以及阿魏酰类低聚糖类物质［4-5］。其中，部分抗氧化成分不仅可作为分析麦麸粉体中的标示物，用于反映糊粉等产品的纯度［6］，而且具有良好的营养生理活性。如果能高效浓缩富集，可以作为小麦深加工增值的一个方向。目前，对小麦麸皮中的生理活性成分提取，主要是碱法和酶法，但由于水解条件和体系中成分的复杂性，很难明确地反映水解效果的好坏。本文旨在比较理想的条件下，通过酶法、碱法水解提取麦麸各生理解剖层中抗氧化活性成分，探明麦麸各生理结构层中抗氧化成分的分布，为后续分离麦麸产品提供参照和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦 济麦22;阿魏酸标准品、DPPH·、3，4，5-三甲氧基肉桂酸 Sigma 公司;木聚糖酶、纤维素酶 诺维信(中国)生物技术有限公司;福林酚试剂 国药集团。

UV1800 紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;Agilent 1100 液相测谱仪HPLC 安捷伦;水浴恒温振荡器 荣华SHA-BA;5804-R 离心机 德国Eppendorf ;pH 计、万分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;0.45μm 有机相微滤膜

上海楚定分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦麸皮解剖层样品制备 称取20g 小麦籽粒，用去离子水浸泡约10h，在籽粒湿润的条件下，用镊子按从外向内依此剥离得到外皮层、中间层和糊粉层，参照Antoine C 的方法［7］。将小麦麸皮解剖层烘干，研磨，使其颗粒过120 目筛，保藏在含P2O5的干燥皿中备用。

1.2.2 酶法提取抗氧化成分 取小麦麸皮样品外皮层、中间层、糊粉层各20mg，精确到0.001g，添加10mL 含1%的木聚糖酶和1%纤维素酶的混合酶液，用磷酸缓冲溶液调节至pH5，55℃条件下，振荡水解3h［8］，5000r/min 离心20min，取上清液，添加1mg/mL的3，4，5-三甲氧基肉桂酸100μL 至水解液中作为内标物。利用3 倍乙酸乙酯萃取3 次，合并有机相，减压浓缩至一定体积，利用氮气吹干，用0.4mL 50%的甲醇水溶液溶解，并使用0.45μm 有机相过滤膜过滤，密封冷藏供高效液相测定。

1.2.3 碱法水解提取抗氧化成份 精确称取麦麸各个生理层样品各20mg，精确到0.001g，添加到10mL的2.0mol/L 的NaOH 溶液中，在氮气存在的条件下，黑暗中水解2h，添加1mg/mL 的3，4，5-三甲氧基肉桂酸100μL 至溶液中作为内标物，利用6μmol/L 盐酸中和至pH =2，利用3 倍体积的乙酸乙酯提取两次，将提取液合并，浓缩，并用氮气吹干，0.4mL 的50%的甲醇溶液溶解，过有机相过滤器过滤，液相测定酚酸含量［6］。

1.2.4 总酚的测定及抗氧化能力测定 将100μL 提取物混入500μL 福林酚试剂，利用1.5mL 的20%碳酸钠中和。反应2h 后，在765nm 波长下测定溶液的吸光度值，重复三次，取平均值。同样的条件下，测定没食子酸与福林酚试剂的混合液的吸光度值，制作标准曲线，总酚含量用(μmol GAE/g)来表示［9］。

取0.1mmol/L 的DPPH·溶液与提取液各2mL，振荡混匀后，置于室温下避光反应40min，然后在517nm 处测吸光值，重复3 次，取平均值［10］。

式中:Ai-平行组的吸光值;A0-空白组的吸光值;P-清除率(%)。

1.2.5 酚酸含量液相测定 液相条件:反相柱C18柱(5mm，250mm ×4.6mm);检测器为紫外检测器;波长320.8nm;流动相:(A)乙腈;(B)pH4.6 的醋酸盐缓冲溶液;进样速率0.8mL/min;柱温35℃;线性比例0～24min，A/B 从15∶85 至35∶65;24～24.5min，从35∶65至60∶40;24.5～29min，从60∶40 至15∶85;29～34min，保持15∶85 的比例5min［11］。

2 结果与讨论

2.1 小麦麸皮生理层比例

对于不同小麦品种，麸皮中的生理结构组成不同。对于本实验中的样品，从20g 小麦籽粒上剥离得到外皮层、中间层和糊粉层的质量分别为:0.54、0.51、1.03g。比例为1.06∶1∶2.02(见表1)，该比例与Hemery 等解剖杜伦麦得到的外皮层、中间层和糊粉层的比例相近［12］。结果如图1 所示，外皮层和中间层主要是由纤维状的细胞组成，糊粉层为厚约50μm的细胞，由细胞壁包裹的两类颗粒组成，不同的组成结构可能使得提取物中的酚酸的成分有所差异［7］。

图1 小麦麸皮解剖层的结构Fig.1 Structer of different layers in wheat bran

表1 小麦麸皮解剖层分析Table 1 Proportion of three layers in wheat bran

2.2 酶法和碱法对麦麸生理层中酚酸提取效果

麦麸的细胞壁主要是由戊聚糖组成，其中阿拉伯木聚糖占其比例的60%～70%［13］。麦麸细胞壁中含有羟基肉桂酸类化合物，如阿魏酸、p-香豆酸、咖啡酸等。由液相测定酚酸的结果(表2)中可以看出，碱解后，糊粉层中单体阿魏酸含量为5.90mg/g，明显高于中间层和外皮层，而外皮层中的阿魏酰聚体的含量最高，为4.34mg/g，是糊粉层中含量的4.6 倍。这主要是由于在小麦麸皮中，组成各个结构层的糖的比例不同。在外皮层中，阿拉伯糖与木糖的比例是糊粉层中比例的三倍［7］。同时，木糖主链之间通过阿魏酰阿拉伯糖结合体相互交联。在糊粉层中，阿魏酸主要以单体形式存在，同时，p-香豆酸在糊粉层中的含量最高，分别是外皮层和中间层中含量的6倍和3 倍，可以做为糊粉层从麦麸中分离程度的判定参照物质。Antoine C 和Hemery 等［6，12］利用碱法提取硬麦(T.aestivum L)皮层中的阿魏酸类物质，在外皮层中阿魏酸脱氢三聚体的含量明显高于其他的生理结构层，可以做计算麸皮层中外皮层比例的生化标示物;而在糊粉层中，单体阿魏酸和p-香豆酸的含量明显高于其它层。

表2 酶法和碱法水解麦麸解剖层的酚酸含量Table 2 Phenolic acid contents of hand isolated parts of wheat grain after alkaline hydrolysis and enzymolysis

利用木聚糖和纤维素酶混合酶液水解后，与碱解后的水解液相比，阿魏酸在外皮层、中间层和糊粉层中释放提取率分别为46.9%、51.0%、56.3%;对阿魏酸脱氢聚体的提取效率为71.0%、52.6%、51.1%。混合酶对糊粉层和中间层中酚酸物质的提取效率较外皮层的高，这可能是由于外皮层的疏水性造成的。外皮层在小麦外皮中起保护胚乳和胚芽的作用，具有较强的疏水性，这可能使得木聚糖酶和纤维素酶与底物的接触受到限制，而糊粉层的细胞壁的可溶性膳食纤维含量高，其内容物中也含丰富的蛋白质和粉状颗粒［14］，具有较强的吸水性，利于酶的接触，从而造成酶解效率的差异。同时，阿魏酸和香豆酸在糊粉层中含量较外皮层中含量高，相同底物浓度的条件下，与底物的接触机率较大，利于酚酸释放。

2.3 总酚含量

从图2 中可以看出，碱水解后，糊粉层的总酚含量最高，为53.1μmol GAE/g，总酚含量从高到低的顺序依次为:糊粉层、外皮层、中间层。酶解后，糊粉层中的总酚含量为28.5μmol GAE/g。由图1 中的趋势可以看出，酶解后，总酚的含量相对碱解后下降。总体上，酶解后与碱解后总酚含量之比，与两种工艺条件下的酚酸提取率相近。酶解和碱解后提取液中的总酚含量比为:58.9∶100、51.8∶100、53.7 ∶100。Anson N M 等［15］研究了布勒公司生产糊粉产品的抗氧化性，表明经碱水解、离心除去蛋白后，总酚含量达50μmol GAE/g。

图2 麦麸结构层酶解和碱解后总酚含量Fig.2 Total phenols content of wheat bran layers after enzymatic and alkaline hydrolysis

2.4 提取物的抗氧化能力

由图3 中可以看出，经过碱水解后，外皮层的抗氧化能力最大，E50为4.3mg/mL，其次为糊粉层，E50为7.5mg/mL。即小麦麸皮各层的清除自由基能力的强弱顺序依次为:外皮层，糊粉层和中间层。经过酶水解后，各组分的提取物的E50都有所增加，但总体的趋势不变，说明水解对外皮层、糊粉层和中间层中抗氧化成分的水解效果差异不明显。碱解和酶解的清除自由基能力的差别同样和酚酸的释放程度有关。研究表明，阿魏酰低聚糖的清除自由基的能力较游离的阿魏酸高，碱解能够破坏木聚糖糖苷键，释放出阿魏酰低聚糖［16］。这是造成外皮层E50低于糊粉层的原因，同时在糊粉层中约含有50%的细胞内容物，而起抗氧化作用的主要成分—酚酸，存在于糊粉细胞壁中，这也造成了糊粉层的抗氧化能力下降［17］。

图3 麦麸解剖层提取物的抗氧能力Fig.3 Antioxidant capacity of wheat bran layers extract

3 结论

总之，通过比较碱解和酶解两种方式对小麦麸皮各解剖层中的酚酸含量释放效果的影响，结果显示，小麦麸皮各个生理层中酚酸的成分和含量有很大差别，经碱解后，在外皮层中，阿魏酰脱氢聚体的含量最高，达4.34mg/g;而在糊粉层中阿魏酸单体的含量最高，达5.90mg/g。由于强碱能够破坏酚酸类物质与多糖连接的酯键，释放出阿魏酸及阿魏酸聚体;而木聚糖和葡聚糖酶只能少量的水解糖苷键。因此，在理想条件下，碱解对酚酸的释放量较酶解更加充分。可以作为评价水解效果的参考标准。同时，提取物中总酚含量和清除自由基能力与多酚含量的释放率直接相关。

［1］Usda.2011 What foods are in the grains group?Available at:http://www.choosemyplate.gov.

［2］Mozaffarian D，Kumanyika S K，Lemaitre R N，et al.Cereal，fruit，and vegetable fiber intake and the risk of cardiovascular disease in elderly individuals［J］.Journal of the American Medical Association，2003，289(13):1659-1666.

［3］Surget B. Histologie du grain de blé［J］. Industrie des Céréales，2005，145:3-7.

［4］Dykes L，Rooney L W.Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits［J］.Cereal Foods World，2007，52(3):105-111.

［5］张志清，姚艳艳，杨雪飞，等.应用粉末活性炭纯化阿魏酸粗提液的研究［J］.食品工业科技，2011，32(12):310-314.

［6］Antoine C，Peyron S，Lullien-Pellerin V，et al.Wheat bran tissue fractionation using biochemical markers［J］.Journal of Cereal Science，2004，39(3):387-393.

［7］Antoine C，Peyron S，Mabille F，et al.Individual contribution of grain outer layers and their cell wall structure to the mechanical properties of wheat bran［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(7):2026-2033.

［8］张璟，欧仕益，张宁，等.酶解麦麸制备低聚糖和阿魏酸的研究［J］.广州食品工业科技，2003，17(1):17-22.

［9］Yu L，Haley S，Perret J，et al. Free radical scavenging properties of wheat extracts［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(6):1619-1624.

［10］滕道祥，马利华，秦卫东.牛蒡多酚的分离纯化及清除DPPH 自由基的研究［J］.合肥工业大学学报:自然科学版，2011，34(5):762-765.

［11］Parker M L，Ng A，Waldron K W.The phenolic acid and polysaccharide composition of cell walls of bran layers of mature wheat(Triticum aestivum L.cv.Avalon)grains［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2005，85(15):2539-2547.

［12］Hemery Y，Lullien-Pellerin V，Rouau X，et al.Biochemical markers:Efficient tools for the assessment of wheat grain tissue proportions in milling fractions［J］.Journal of Cereal Science，2009，49(1):55-64.

［13］郑学玲.小麦麸皮戊聚糖的分离制备，理化性质及功能特性研究［D］.无锡:江南大学，2002.

［14］Bacic A，Stone B.Chemistry and organization of aleurone cell wall components from wheat and barley［J］.Functional Plant Biology，1981，8(5):475-495.

［15］Anson N M，Van Den Berg R，Havenaar R，et al.Ferulic acid from aleurone determines the antioxidant potency of wheat grain(Triticum aestivum L.)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(14):5589-5594.

［16］袁小平.酶解麦麸制备阿魏酰低聚糖及其生物活性的研究［D］.无锡:江南大学，2006.

［17］Adom K K，Sorrells M E，Liu R H.Phytochemicals and antioxidant activity of milled fractions of different wheat varieties［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(6):2297-2306.