酶法提取板栗雄花序中黄酮类物质的关键技术研究

杨 威，常 虹 ，谢 敏，赵丽芹

(1.北京市农林科学院农业综合发展研究所，北京100097;2.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特010018)

板栗雄花序为葇荑花序，所含花粉营养丰富，各种成分配比均衡，板栗花粉中含有黄酮、雌二醇、蛋白质、氨基酸、多种矿物质元素、脂肪、近百种酶和辅酶及核酸、单糖、多糖等［1］。尤其是板栗花中含有丰富的黄酮类物质，黄酮类物质具有抗氧化和清除自由基［2］的作用，其生理功能包括抗癌变［3］、防止动脉硬化、降低血脂和胆固醇，在改善血管通透性及减少冠心病发病率［4］方面都有良好的效果。其他的功能特性还包括降血糖、调节激素和增强机体的非特异免疫功能和体液免疫功能［5-6］、对于肝脏的保护、炎症的祛除以及抗过敏方面亦有良好的功效［7-9］，基于其对人体拥有极佳的保健功能，因此逐渐受到国内外广泛关注。目前市面上常见的都是从花粉中提取黄酮类物质，常用的提取方法有水提法、醇提法［10］等，但无论是在操作的难易程度、提取时间、提取剂的用量和挥发上，还是在黄酮类物质的提取量上，都不能做到十分令人满意。本实验以板栗花雄花序作为实验原料，采用酶法来提取板栗雄花序中的黄酮类物质，为板栗雄花序中黄酮类物质的进一步研究和今后的加工方式提供理论依据［11-12］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

板栗雄花序 采于北京市农林科学院板栗示范基地，精选花粉充实、无病虫害的板栗雄花序;芦丁 中国药品生物制品检定所，分析纯;无水乙醇 北京化工厂，化学纯;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 西陇化工厂，均为分析纯;纤维素酶和果胶酶(2.4Aua/g)诺维信(中国)生物技术有限公司。

TU-1901 双光束紫外可见分光光度仪 北京普析通用仪器有限责任公司;SY-1000E 多用途恒温超声提取机 北京弘祥隆生物技术开发有限公司;中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;电子天平 常熟市衡器厂;酸度计 上海理达仪器厂;飞鸽牌离心机 上海安亭科学仪器厂;HHS 型电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制作 精密称取芦丁15mg，用60%乙醇完全溶解在100mL 容量瓶中，用60%乙醇定容，摇匀，此时每1mL 溶液含无水芦丁0.15mg。准确量取上述芦丁溶液1、2、3、4、5mL，分别置于10mL 容量瓶中，然后先加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，再放6min，加4%氢氧化钠溶液4mL，用60%乙醇稀释至刻度，在波长510nm 下测其吸光度，然后以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线［13］。

1.2.2 酶法提取板栗雄花序中黄酮类物质 取阴干放置的板栗雄花序，经干燥和粉碎后，加入30mL 浓度为70%的乙醇溶液，在一定的温度、酶用量等条件下，采用酶法提取，经过20min，4000r/min 的离心过滤后，收集提取液，按照测定黄酮类化合物标准曲线的方法，在510nm 下，测定其吸光值，代入回归方程中，求出提取液中黄酮类化合物的含量，并按照以下公式来计算板栗雄花序中黄酮类化合物的得率:

1.2.3 超声波提取板栗雄花序中黄酮类物质 在预实验的基础上，采用超声波提取板栗雄花序中的黄酮类物质，先进行单因素实验，然后再进行正交实验，最后得出超声波提取的最佳方案为提取温度65℃，料液比1 ∶135，超声波功率为300W，提取50min，然后测定提取液的吸光值，计算得率。

1.2.4 酶法提取板栗雄花序中黄酮类物质

1.2.4.1 酶解pH 对板栗雄花序黄酮类物质提取的影响 称取板栗花花粉1g，在复合酶(纤维素酶∶果胶酶=1∶1)用量1.0%(E/S)，酶解温度为50℃条件下，酶解1h，酶解pH 选择3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，研究酶解pH 对板栗花黄酮提取效果的影响。

1.2.4.2 加复合酶量(纤维素酶∶果胶酶=1∶1［12］)对板栗雄花序黄酮类物质提取的影响 称取板栗花粉1g，酶解温度为50℃条件下，酶解1h，酶解pH 为4.0，复合酶量选择0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%(E/S)，研究复合酶量对板栗花黄酮提取效果的影响。

1.2.4.3 酶解温度对板栗雄花序黄酮类物质提取的影响 称取板栗花花粉1g，复合酶(纤维素酶∶果胶酶=1∶1)用量0.8%(E/S)，酶解pH 为4.0，酶解1h，酶解温度选择35、40、45、50、55℃，研究酶解温度对板栗花黄酮提取效果的影响。

1.2.4.4 酶解时间对板栗雄花序黄酮类物质提取的影响 称取板栗花花粉1g，复合酶(纤维素酶∶果胶酶=1∶1)用量0.8%(E/S)，酶解温度为40℃，酶解pH 为4.0，酶解时间选择30、60、90、120、150min，研究酶解pH 对板栗花黄酮提取效果的影响。

1.2.4.5 酶法辅助提取板栗雄花序黄酮类物质的正交实验 在单因素实验的基础上，设计温度、酶用量、pH、时间四因素三水平正交实验，正交实验水平表见表1。

2 结果与分析

2.1 黄酮类物质测定的标准曲线

根据亚硝酸钠-硝酸铝显色测得芦丁浓度与吸光值的关系，绘制标准曲线如图1 所示。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

以芦丁质量浓度C(mg/mL)对吸光度A 做线性回归，得方程为:y =1.689x-0.0253，R2=0.9999。

2.2 酶法对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响

2.2.1 酶解pH 对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响 由图2 可知，当pH 为4.0 时，板栗雄花序黄酮类物质得率达到最大5.2%，当pH 大于4.0 以后，板栗雄花序黄酮类物质的提取量呈大幅下降趋势，当pH 为5.5 时，板栗雄花序黄酮类物质得率达到最小值3.85%。这是因为酶的活性受pH 影响较大，当pH 为4.0 时，复合酶发挥最大活力，破坏细胞壁，降低传质阻力，使得黄酮类物质的溶出效率也达到最大值，当pH 大于4.0 时超出了酶的最佳活力范围，所以板栗雄花序黄酮类物质的提取量就会降低。因此，酶法辅助提取板栗雄花序黄酮类物质的最佳pH 为4.0。

图2 酶解pH 对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响Fig.2 The effect of pH on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

2.2.2 加复合酶量对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响 由图3 可知，随着复合酶用量的增大，酶与底物作用的机会逐渐增多，酶的催化效率亦逐渐升高，当复合酶用量增大到0.8%时，黄酮类物质得率达到最大值4.73%。继续添加复合酶用量，黄酮类物质的提取量却略有下降，可能的原因是酶量过高，底物浓度不能对酶达到饱和，致使酶的作用受到抑制。因此，本实验选用0.8%为酶的最佳添加量。

2.2.3 酶解温度对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响 由图4 可知，当酶解温度为40℃时，板栗雄花序黄酮类物质得率达到最大值5.44%，当酶解温度大于40℃以后，板栗雄花序黄酮类物质的提取量呈下降趋势，当酶解温度为55℃时，黄酮类物质得率达到最低4.53%。这可能是因为酶在40℃左右活性最强，当酶解温度较低时，酶活力低;当酶解温度超过40℃时，酶蛋白质变性，酶活力减弱甚至丧失活性。因此酶法辅助提取板栗雄花序黄酮类物质的最适温度为40℃。

图3 加酶量对板栗雄花序黄酮提取效果的影响Fig.3 The effect of the concentration of enzyme on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

图4 酶解温度对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响Fig.4 The effect of the temperature of enzymatic hydrolysis on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

2.2.4 酶解时间对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响 由图5 可知，当酶解时间为60min 时，板栗花黄酮类物质的得率达到最大5.3%，当酶解时间超过60min 以后，板栗雄花序黄酮类物质的提取量呈大幅下降趋势，当酶解时间为150min 时，板栗雄花序黄酮类物质的得率达到最小4.53%。这是因为过长的时间可能会导致酶失活，而且酶解太长时间可能会引起黄酮化合物结构变化，导致总黄酮含量降低。因此酶法辅助提取板栗雄花序黄酮类物质的最佳时间为60min。

图5 酶解时间对板栗雄花序黄酮类物质提取效果的影响Fig.5 The effect of the time of enzymatic hydrolysis on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

2.2.5 酶法辅助提取板栗雄花序黄酮类物质的正交实验 从表2 可以得出，影响板栗雄花序中黄酮类物质得率的主次顺序为B ＞D ＞A ＞C，即酶用量＞时间＞温度＞pH。通过验证实验，得出在A2B3C1D1的工艺条件下黄酮类物质的得率为5.2%，高于工艺条件A2B3C1D2下黄酮类物质得率5.1%。因此酶法提取黄酮类物质的最佳工艺条件为温度40℃，复合酶用量0.9%，pH3.75，提取时间为45min，黄酮类物质的得率为5.2%。

表2 酶法提取板栗雄花序黄酮类物质的正交实验结果表Table 2 The result by orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis for flavonoids from chestnut male inflorescence

2.3 酶法提取和超声波提取方法的比较

由表3 可知，超声波法提取得率为4.6%，而酶法提取得率为5.2%，酶法要比超声波提取法得率高出6%，而且无论从提取时间上，料液的使用上，还是能量的消耗上，酶法与超声波法相比都具有一定的优势。

表3 酶法与超声波法提取方法的比较Table 3 The comparison between enzymatic hydrolysis and ultrasonic extraction

3 结论

在板栗雄花序黄酮类物质的提取上选用酶法提取，酶法提取复合酶用量＞时间＞温度＞pH。最佳提取条件为:温度40℃，复合酶用量0.9%，pH3.75，提取时间为45min，在此条件下，黄酮类物质提取的得率为5.2%。酶法比超声波法提取板栗雄花序黄酮类物质具有明显的优势，还具有节省料液，降低能量损耗和提取方法温和的特点。

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