VEGF基因沉默对肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的影响

宋向芹，司秀文，张 芳，赵延婷

(滨州医学院临床学院，山东滨州256603)

研究表明［1，2］肝癌的发生是一个多基因参与、通过不同基因表达进行调控的复杂过程，癌细胞早期侵袭转移是肝癌患者死亡的重要因素之一［3］。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是目前已知在原发性肝癌血管生成中作用最强的血管生成诱导因子，可通过作用于血管内皮细胞、提高血管的通透性、促进肝癌细胞的增殖促进肝癌的发生、发展［4］。2011年1月～2012年1月，我们采用RNA干扰技术沉默VEGF基因，观察其对人肝癌细胞株HepG2迁移和侵袭的影响，为肝癌的临床治疗提供理论和实验依据。现将相关研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 PCR引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，脂质体转染试剂 (Lipofectami 2000，Invitrogen公司)，质粒提取试剂盒(北京天根公司)，凝胶回收试剂盒和反转录试剂盒［宝生物工程(大连)有限公司］。质粒pGenesil-1和人肝癌细胞株HepG2由本实验室保存。

1.2 HepG2的培养 HepG2培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 U/mL链霉素的DMEM完全培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内孵育。显微镜下观察细胞生长情况。当细胞生长融合80% ～90%时，用0.25%的胰酶消化传代，选用对数生长期细胞实验。

1.3 VEGF-siRNA重组载体的构建、转染和VEGF基因沉默 采用siRNA技术沉默HepG2细胞内VEGF基因。由上海吉玛制药技术有限公司合成针对VEGF的3种siRNA和1个阴性对照，对pGenesil-1质粒进行双酶切，再进行pGenesil-1质粒酶切大片段产物的回收与纯化，用 T4DNA连接酶将干扰片段与pGenesil-1载体连接起来，成功构建3种siRNA表达载体和1个阴性对照，分别命名为pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3 和 pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。用0.25%的胰酶消化 HepG2，将细胞接种于6孔板中，5×105/孔，当细胞的融合至70% ～80%时Lipofectamin 2000)介导将pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3分别转染 HepG2。转染前24 h更换为无抗生素的DMEM完全培养基，转染6 h更换为正常的DMEM培养液。用RT-PCR法［5］筛选出沉默效果最好(即VEGF表达量最少)的siRNA片断即pGenesil-1-VEGF-shRNA-2(见图1)。

图1 HepG2中VEGF mRNA表达量

1.4 细胞创伤愈合试验 根据文献［6］的方法，将pGenesil-1-VEGF-shRNA-2转染HepG2(观察组)，以转染pGenesil-1空质粒细胞(空载组)和未转染的空白细胞(空白组)作为对照。将三组细胞分别接种于24孔板中(5×105/孔)，待细胞生长至单层完全融合时，以100 μL微量移液枪头在单层细胞上呈“一”形划痕，制造细胞创伤模型，每组平行3个样本，记录划痕区相对距离。PBS冲洗2～3次后继续培养。24 h后在显微镜下监测创伤愈合程度，并于200倍视野下拍照。用电子尺软件分别测量每组在0、24 h划痕两侧细胞间的距离，按公式计算迁移速度(迁移速度=迁移距离/迁移时间)。

1.5 Transwell小室体外侵袭试验 根据文献［7］的方法进行三组细胞体外侵袭试验。比较三组穿膜细胞数。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件，数据用¯x±s表示，采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组细胞迁移速度为(3.02 ±0.03)μm/h，明显慢于空载组的(8.67±0.02)μm/h和空白组的(8.78 ±0.03)μm/h，P 均 ＜0.05。观察组穿膜细胞数为(14.0±1.3)个，显著低于空载组的(35.0±2.3)个和空白组的(36.0 ±2.5)个，P 均 ＜0.05。

3 讨论

肝癌的发生发展与肿瘤血管生成有密切的联系［8］。肝癌组织中VEGF的表达显著高于正常肝组织［9］，且随着肝癌的进展呈上升趋势。已有研究表明VEGF是潜在的肝癌预后分子之一［10］。因此，抑制VEGF的表达是抗肝癌血管生成治疗的有效途径之一。

RNA干扰是近年来发现的利用外源性或内源性双链RNA以高度序列特异性方式抑制基因表达的过程，具有高靶向性、高稳定性、高效率性、高特异性及高穿透性等特点。它是通过双链RNA的介导特异地降解相应序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后水平，使基因沉默［11］。

本研究采用siRNA技术沉默VEGF mRNA，成功构建针对VEGF的3种siRNA表达载体和1个阴性对照，在相同条件下转染相同细胞，产生的干扰效果有差异，其中以pGenesil-1-VEGF-shRNA-2干扰效果最好，其抑制效果接近80%，可作为下一步分析研究的优选干扰片断。本研究中细胞创伤愈合试验显示，观察组即pGenesil-1-VEGF-shRNA-2重组质粒细胞迁移速度较空载体组和空白组明显减慢(P均＜0.05)，说明VEGF与肝癌细胞的迁移有关。细胞体外侵袭试验能间接反映HepG2的侵袭能力。Transwell小室试验结果表明转染 pGenesil-1-VEGF-shRNA-2细胞即观察组穿膜细胞数明显减少，与空载组和空白组相比，P均＜0.05。这表明VEGF下调可以显著降低肝癌细胞株HepG2的体外侵袭能力。VEGF基因与肝癌细胞株HepG2的发生、发展密切相关，VEGF基因 siRNA表达载体可以抑制HepG2细胞的迁移和侵袭，因此VEGF在HepG2的生长转移过程中起重要作用，为临床靶向干预VEGF信号通路，抑制肝细胞癌转移提供分子生物学基础，但是导致这些改变的分子机制仍有待进一步研究。

总之，我们采用 RNA干扰技术成功合成的VEGF siRNA，证实能特异、有效地抑制体外肝癌HepG2细胞中VEGF的表达，并可望通过靶向阻断VEGF表达途径以阻断VEGF促血管形成，从而阻止肝癌的生长与转移，为肝癌治疗开辟新途径。

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［5］徐恒瑰，赵永福，苗小艳，等.VEGF-A siRNA对人肝癌HepG2细胞体外增殖、侵袭及化疗敏感性的影响［J］.解剖科学进展，2009，15(1):40-43.

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