PTEN、survivin基因表达与胃癌化疗药物敏感性的相关性研究

王新立 张 强 王宗福

(泰山医学院附属医院病理，山东泰安 271000)

胃癌(Gastric carcinoma，GC)是消化系统最常见恶性肿瘤。化疗在胃癌的治疗中占有越来越重要的地位。但是人们逐渐发现多数肿瘤特别是实体肿瘤化疗效果仍不理想，其主要原因是在许多肿瘤中存在多种耐药基因的扩增，使化疗不可避免地存在盲目性及随意性，造成了胃癌化疗效果欠佳，继发性耐药及不必要的毒副作用。因此通过药敏实验，在化疗实施前筛选出有效的药物，对于实现肿瘤化疗的合理化、个体化用药有实用价值。

PTEN基因作为第一个被发现的具有双重特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，在细胞的生长发育、凋亡、迁移、信号传递等方面起着重要的调控作用［1］．

Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，新近研究表明survivin可能还与肿瘤的化疗药物的耐药性和预后有关，可能成为一种新的耐药标志［2］。

1．1 临床资料

收集泰山医学院附属医院2009年4月至2011年2月外科手术切除的80例胃癌标本。所有病例均经胃镜活检病理证实且术前未行化疗、放疗。其中男性51例，女性29例，年龄32岁～74岁，中位年龄56岁。

1．2 肿瘤细胞悬液制备

在超净工作台上，胃癌组织用灭菌PBS冲洗3遍，无菌剪刀剪成糊状，200目铜网研磨过滤，过滤后以3000 r/min离心10 min，去掉上清后用Hanks液漂洗二次后，用台盼蓝染色记数活细胞数大于95%，用10%胎牛血清RPMI－1640培养液重悬，用血细胞计数板调整单细胞悬液至活细胞浓度(2～3)×105个/ml。

2．3 MTT药物敏感试验

实验分为3组，(1)用药组:取分离纯化后的单细胞悬液加入96孔培养板，每孔180 μl，分别加入药物终浓度为10倍血浆峰值浓度的羟基喜树碱(HCPT)、顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、5 － 氟尿嘧啶(5－FU)、丝裂霉素(MMC)，每组药物设4个复孔;(2)对照组:每孔加入分离纯化后的单细胞悬液180 μl，不加药物;(3)空白组:加 180 μl培养液，无培养细胞;置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h后，加入5 mg/m l的MTT10 μl于各孔，继续培养4小时。加入0．04 N盐酸异丙醇100 μl/孔充分溶解所生成的甲瓚，静止10 min，通过酶标仪在570 nm波长检测光密度值(OD值)的变化。取4复孔OD值的平均值作为细胞在此药物组的平均OD值。肿瘤细胞抑制率=(对照组OD值－用药组平均OD值)/(对照孔平均OD值－空白组OD值)×100%。判断标准:肿瘤细胞抑制率＞5O%为高度敏感，30～50%为中度敏感，＜30%为不敏感，既为耐药。

1．4 免疫组化实验及判定标准

应用免疫组化SP法对80例标本进行PTEN、survivin蛋白的表达。严格按试剂盒说明进行。结果判定:根据相关文献［3］制定，采用双盲法对每张切片在高倍镜(×400)下计数5个视野。以染色强度分别计为:0分为细胞膜和/或细胞浆内无染色颗粒;1分为细胞膜和/或细胞浆内有黄染的细小的颗粒;2分为细胞膜和/或细胞浆内有较多的黄色颗粒;3分为细胞膜和/或细胞浆内有粗大的棕黄色颗粒。再以染色阳性细胞比例分别计为:0分为无阳性细胞;1分为阳性细胞数为1～25%;2分为阳性细胞数为26～50%;3分为阳性细胞数为51～100%。最后免疫组化染色结果以两项相加得分 ＞2分为阳性，0～2分为"－"，3～4分为"+"，4～5分为"++"。

1．5 统计学分析

所有实验数据采用SPSS12．0统计包进行分析，用χ2检验，连续性校正χ2检验和Fisher精确概率计算法进行计数资料的显著性检验，用spearman等级相关进行两变量间的相关性分析。P＜0．05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 胃癌组织中PTEN蛋白表达与化疗药物体外抑制率的关系。

将MTT检测结果中抑制率≥30%者判为敏感，而＜30%者判为耐药。PTEN蛋白阳性表达与HCPT、CDDP、5－FU、ADM 及MMC 的体外耐药无相关性(P=0．890，P=0．527，P=0．219，P=0．185，P=0．594)，P 值均大于0．05(表1)。

表1 胃癌组织中PTEN表达结果与MTT药敏的关系

2．2 胃癌组织中PTEN蛋白表达与化疗药物体外抑制率的关系survivin阳性表达与5－FU及ADM的体外耐药性有统计学意义(P=0．012、P=0．035)，P 值均小于 0．05;而与 HCPT、CDDP 及 MMC的体外耐药性无关(P＞0．05)(表2)。

2．3 胃癌组织中PTEN与survivin之间表达的相关性

在胃癌组织中 PTEN阳性表达(39/80，48．75%)、Survivin 阳 性 表 达 (54/80，67．50%)，spearman等级相关性分析表明:两者呈负相关(rs=－0．668，P=0．000)，结果具有统计学意义，说明两者在胃癌发生中可能具有协同作用。(表3)

表2 胃癌组织中survivin表达结果与MTT药敏的关系

表3 PTEN与survivin表达的关系

图1 印戒细胞癌PTEN阳性表达 SP法×200

图2 高分化腺癌survivin阳性表达 SP法×200

图3 未加药物的肿瘤细胞对照组细胞生长良好 ×200

图4 原代胃癌细胞化疗药物作用后胞浆、胞核固缩，胞内出现空泡×200

3 讨论

化疗作为全身性治疗手段在恶性肿瘤的治疗中具有不可替代的作用，尤其对已处于转移和播散期的胃癌患者，有效化疗是延长生存期必不可少的方法。但由于肿瘤细胞生物学特性的差异以及对化疗药物产生耐药等原因，即使相同组织学类型及分化程度的恶性肿瘤在不同个体临床治疗效果也不一致，因此研究不同个体肿瘤的生物学特性及对不同化疗药物的敏感性具有重要的实用价值。

3．1 MTT法药敏实验的科学性

国内外许多学者研究表明，肿瘤细胞的体外药敏试验结果与体内疗效的符合率达80%以上，且试验结果为阴性者，几乎可以肯定为体内临床用药的耐药病例。Nakamura［4］等对胃癌术后患者通过MTT法药敏检测后实施用药和凭临床经验用药者及术后未用药者进行比较，发现前者的生存率明显高于后两者。但对制备单细胞悬液时肿瘤细胞与非肿瘤细胞混杂，是否影响MTT结果说法不一。近来文献表明，有作者专门进行实验研究，发现混杂非肿瘤细胞的短期培养MTT比色分析法虽然相比胃癌原代细胞纯化培养后药敏精确性略低，但结果具有一致性，相关性好，能够反映药敏基本趋势及个体化差异。因此，通过肿瘤细胞的原代培养以及MTT法药敏检测试验针对胃癌不同个体而筛选敏感化疗药物是克服胃癌耐药性和提高患者生存率的有效途径之一。

3．2 PTEN 定位于人类染色体 10q23．3，全长200kb，mRNA长度为5．5kb，有9个外显子和8个内含子。大量的证据表明PTEN是一个强有力的抑癌基因，在多种肿瘤中频繁发生突变，其突变频率可以与P53相匹敌，这些特点使其成为后P53时代最引人注目的一种肿瘤抑制基因。刘晋，吕小红等［5］以无内源性pten表达的人胃癌BGC823细胞株转染PEAK8空载质粒和PEAK8－pten质粒，给予足叶乙苷和阿霉素诱导，RTPCR方法分析目的基因的表达，免疫沉淀后Western－blot检测AKT活性。RT－PCR显示转染pEAK8－pten质粒组有pten强表达。pten基因的导入对化疗药诱导的AKT活性有抑制作用。结论:pten基因转染能抑制人胃癌BGC823细胞体外生长，促进凋亡，并通过抑制AKT活性加强化疗药物的疗效。但本实验结果显示:PTEN蛋白阳性表达与 HCPT、CDDP、5－FU、ADM及MMC的体外耐药无相关性(P=0．890，P=0.527，P=0．219，P=0．185，P=0．594)，P 值均大于0．05。

3．3 Survivin是IAP家族中一个结构独特的新成员。于1997年由耶鲁大学的Altieri等 ，用效应细胞蛋白酶受体－1(effectorcell protease receplor－1，EPR－1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来。因为具有强大的抗细胞凋亡功能，故命名为存活素。陈振勇等［6］，通过RT－PCR和蛋白印迹方法，研究发现经过化疗药物处理的胃癌细胞株，在一段时间内，Survivin表达率增高，从25%(5/20)升高到70%(14/20)，相应伴随凋亡细胞数减少。在胃癌患者身上，术前接受过化疗的患者，Survivin表达也从35%(14/40)升高到60%(18/30)。结果提示Survivin表达可能与肿瘤细胞化疗耐受有关。目前具体原因不甚明确。推测这种表达的升高有两种可能，一种是化疗对Survivin表达较高的癌细胞不敏感，在杀伤了大部分敏感细胞后，剩下的是不敏感的Survivin表达较高的癌细胞;另一种情况是化疗本身可能诱发了Survivin的表达，增加了肿瘤细胞的生存力。各种外在因素如化疗对肿瘤组织的破坏有可能引起肿瘤细胞继发性的自身保护，Survivin表达的升高可能就是这种保护的一种。Survivin参与了细胞化疗耐受，抑制Survivin表达，有可能逆转化疗抵抗，为化学药物治疗肿瘤提供了一个新的途径。本研究结果表明survivin阳性表达者与5－FU及ADM耐药有关(P＜0．05)，提示survivin可作为胃癌原发性耐药标志之一。

3．4 survivin与PTEN表达的关系

董吉顺等［7］采用免疫组化法检测156例胃癌组织的survivin及PTEN表达，其结果显示:PTEN阳性表达(64/156，41．03%)、Survivin 阳性表达(102/156，65．38%)，两者呈负相关(P ＜0．01)。王东升等［8］研究发现在65例胃癌组织中survivin、PTEN的阳性率分别为(46/65，70．77%)、(31/65，47．70%)两者呈负相关。本研究结果与之一致，说明survivin、PTEN在胃癌发病过程中可能具有协同作用，survivin基因表达增强在促进细胞发生恶变的同时，还可能通过交叉途径抑制PTEN的表达，使PTEN的表达下调，减弱其抑癌作用，最终两基因表达的改变协同导致了正常胃粘膜向胃癌的转变，联合检测它们可对胃癌恶性程度的判定、预后分析和进一步治疗提供有效的依据。

［1］ WENG L，BROWN J，ENG C．PTEN induces apoptosis and cell cycle arrest through phosphoinositol－3－kinase/Akt－dependent and － independent pathways［J］．Human Molecular Genetics，2001，10(3):237－242．

［2］ IKEGUCHI M，LIU J，KAIBARA N．Expression of survivin mRNA and protein in gastric Cancer cell line(MKN－45)during cisplatin treatment［J］．Apoptosis，2002，7(1):23 －29．

［3］ 王晨，卫建平，张晓琴，等．五种乳腺癌预后相关指标在乳腺肿瘤中的表达及其临床意义［J］．中国药物与临床，2005，5(8):602－606．

［4］ NAKAMURA R，SAIKAWA Y，KUBOTA T，et al．Role of the MTT chemosensitivity test in the prognosis of gastric Cancer patients after postoperative adjuvant chemotherapy［J］．Anticancer Research，2006，26(2B):1433－1437．

［5］ 刘晋，吕小红．pten基因对人胃癌BGC823细胞P13K/AKT耐药通路的影响［J］．中国医院药学杂志，2011，21(10):1784－1786．

［6］ 陈振勇，陈道达，朱鹏，等．生存蛋白Survivin在人胃癌组织中的表达［J］．肿瘤防治杂志，2004，11(8):823 －825．

［7］ 董吉顺，倪灿荣．胃癌中survivin、PTEN、cyclinD1和p53基因的表达及其相关性［J］．临床与实验病理学杂志，2003，19(4):396－400．

［8］ 王东升，仲蓓，姜艳．胃癌组织中Survivin，PTEN，P53基因的表达及意义［J］．山东医药，2008，43(36):6 －9．