金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脂褐素和脑组织形态学的影响

饶 娜 杨国栋 安 芳 王书华 (河北北方学院药学系，河北 张家口 075000)

金莲花是毛茛科植物金莲花的干燥花及花蕾，有清热解毒，消肿明目的功效，临床上主要用于上呼吸道感染、扁桃体炎〔1〕等。荭草苷和牡荆苷在金莲花黄酮中含量较高〔2〕，金莲花总黄酮及其单体荭草苷和牡荆苷具有体外抗氧化〔3，4〕、抗肿瘤〔5～7〕等作用，药代动力学研究表明，荭草苷、牡荆苷广泛分布于动物体内的各组织，肾脏中浓度最高〔8，9〕。从中医学角度来说，药物入肾，对于提高机体免疫力，抗衰老、抗肿瘤等提供了一个有力的证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂 荭草苷和牡荆苷(河北北方学院实验中心自制，经1H-NMR和HPLC鉴定纯度98.9%);D-半乳糖(分析纯，上海试一化学试剂有限公司);硫酸奎宁(分析纯，上海齐奥化工有限公司);实验用水为三重蒸馏水。

1.1.2 动物 昆明种小鼠(河北北方学院动物中心提供)。

1.1.3 仪器 XDS生物显微镜(重庆光电仪器总公司);H-7500透射电 子显微镜(日本);F-5100荧光分光光度计(日本);MP1100B型电子天平(上海精科天平仪器厂);GR-202型AND分析天平(日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 采用 D-半乳糖致亚急性衰老法〔10〕，将D-半乳糖10000 mg溶于500 ml生理盐水中，按注射剂量200 mg·kg－1·d－1(即每克体重0.01 ml)给小鼠腹腔注射，正常对照组注射等体积生理盐水，造模时间为8 w，每天称重一次，依据末次称重的克数调整给药剂量。

1.2.2 模型验证 造模第6周和第8周分别选取正常组和造模组小鼠(备用)8只，摘眼球采血，分离血清，测定总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，以验证小鼠衰老情况。第8周末，造模组小鼠指标与正常组相比具有统计学意义，显示模型复制成功。

1.2.3 给药方法 荭草苷和牡荆苷溶液的配制:荭草苷和牡荆苷先用N，N-二甲基甲酰胺溶解后，再加吐温-80助溶，轻轻振荡使混匀，然后再加入生理盐水(N，N-二甲基甲酰胺∶吐温-80∶生理盐水 =1∶1∶20)。

正常组和模型组给等体积的生理盐水，治疗组分荭草苷、牡荆苷高(40 mg/kg)、中(20 mg/kg)、低(10 mg/kg)三个剂量组(按文献〔8〕换算给药剂量)，从第9周始每日上午分别灌胃给药，维生素E对照组给药剂量是20 mg/kg，依据小鼠体重调整给药剂量，给药时间8 w。

1.2.4 小鼠一般状态观察 观察各组小鼠一般状态，摄食及饮水情况、活动度、毛色、光泽度等方面的改变情况。

1.2.5 小鼠脑组织重量的比较 精密称重各组小鼠全脑的重量，小鼠衰老后，脑组织微观上会发生脑细胞的凋亡减少，宏观上表现出脑萎缩等现象，观察比较小鼠脑组织的重量。

1.2.6 小鼠脑组织脂褐素含量测定 利用脂褐素在紫外光激发下脂褐素能产生自发荧光，并且其荧光值与脂褐素值相对应的特点，测定脑组织脂褐素的含量。计算出每克组织中所含相当于标准液荧光强度的荧光物质微克数〔11〕。

(1)样本处理将小鼠断头处死，取出脑组织在生理盐水中浸泡，用滤纸沥干表面血液污渍，按体积重量比为20∶1加入氯仿∶甲醇(V/V=2∶l)混合液，制成10%组织匀浆，再加入等体积蒸馏水，充分振摇3 min，3000 r/min离心10 min，吸出氯仿层，再加氯仿定容至5 ml。(2)用荧光分光光度计测定其荧光强度(激发光波长360 nm，发射光波长420 nm，狭缝10 nm)。以新配制的硫酸奎宁标准液(1 μg/ml)荧光强度为50，计算每克大脑皮层中所含相当于标准荧光强度的荧光物质微克数，即为脂褐素含量。

1.2.7 脑组织形态学的观察

1.2.7.1 小鼠脑组织形态学光镜观察 小鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，然后打开胸腔，夹闭腹主动脉，经左心室插管入主动脉，灌注生理盐水100～150 ml，快速冲洗，待血液冲洗干净以后，马上灌注含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2～7.4)以固定脑组织。灌注完毕后，断头取脑，矢状面切取脑组织0.1 cm，置于4%多聚甲醛中固定。固定完毕后，将标本取出，经梯度酒精逐级脱水，应用HE染色法制作脑组织病理片。在光学显微镜下观察小鼠脑组织的病理表现。

1.2.7.2 小鼠脑组织形态学电镜观察 用10%的水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)，将小鼠麻醉，打开胸腔，经左心室插管进入主动脉，灌注生理盐水，同时挑破右心耳，快速冲洗，待血液冲洗干净以后，立即灌注含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2～7.4)以固定脑组织。灌注完毕后，断头取脑，分离小鼠海马区，放入2.5%戊二醛中固定，将固定好的样本进行小鼠海马区的超微结构观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行处理，结果用±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰小鼠一般形态的影响正常组小鼠饮食正常，活泼好动、毛发光亮、浓密，皮肤弹性良好。模型组小鼠逐渐表现出少动，行动迟缓，喜蜷缩，毛色发黄，尤其是腹部毛发逐渐变得无光泽、稀疏并渐有脱毛现象，皮肤松弛，弹性下降。而各治疗组在服用相应的药物后，总体状态好于模型组。

2.2 荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑重量的影响造模后小鼠脑组织发生了萎缩，正常组小鼠脑组织重量与模型组相比，具有显著性差异(P＜0.05);与模型组相比，荭草苷和牡荆苷高、中剂量组都具有显著性差异(P＜0.05)，荭草苷高、中、低剂量组与牡荆苷各剂量组相比较，无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

2.3 小鼠脑组织脂褐素的测定结果 正常组小鼠脑组织内脂褐素的含量明显低于模型组，具有显著性差异(P＜0.01);荭草苷和牡荆苷各治疗组的脂褐素含量明显降低，与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01);与VE组相比，荭草苷及牡荆苷中、低剂量组降低脑组织脂褐素含量均具有显著性差异(P＜0.05)，荭草苷和牡荆苷高剂量组与VE组相比无显著性差异(P＞0.05);荭草苷高、中、低剂量组与牡荆苷各剂量组相比较，无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

图1 各组大鼠脑组织病理学观察(HE，×400)

2.4 小鼠脑组织形态学的观察结果 (1)光镜下病理学观察结果见图1。正常组小鼠脑组织细胞膜完好、排列整齐，无细胞变性，模型组小鼠脑组织细胞数量明显减少，细胞排列不整齐，细胞空泡变性，各治疗组小鼠脑组织细胞的数量和细胞排列较模型组明显改善。(2)电镜观察结果见图2。小鼠脑组织海马区超微结构，正常组细胞轮廓清晰，细胞膜完整，细胞核呈圆形和卵圆形，核仁清晰，细胞质中线粒体清晰，无脂褐素沉积，模型组细胞超微结构明显改变，可见神经元细胞萎缩，细胞器结构不清或变形，线粒体膜出现部分损伤，出现肿胀变性、核膜模糊、核边移、脂褐素沉积明显增多，各治疗组细胞超微结构显著改善，其中以荭草苷与牡荆苷高、中剂量组明显。

图2 各组大鼠超微结构变化(×15000)

表1 荭草和牧荆苷对小鼠脑重量、脂褐素的影响( ± s，n=10)

表1 荭草和牧荆苷对小鼠脑重量、脂褐素的影响( ± s，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与VE组比较:3)P＜0.05

组别 脑重量(g) 脂褐素(μg/g)0.491±0.037 18.25±1.62模型组 0.412±0.034 26.54±1.21 VE组 0.460±0.0321) 21.37±1.231)高剂量荭草苷组 0.451±0.0381)3) 21.12±1.301)中剂量荭草苷组 0.442±0.0261)3) 22.51±0.971)低剂量荭草苷组 0.431±0.0311)3) 23.65±0.821)2)高剂量牡荆苷组 0.446±0.025 22.26±1.031)中剂量牡荆苷组 0.423±0.0221)3) 24.01±0.951)2)低剂量牡荆苷组 0.426±0.0311) 25.07±0.672)正常组

3 讨论

D-半乳糖所致的亚急性衰老模型，是根据细胞内糖代谢紊乱，导致最终破坏机体抗氧化防御系统，积聚大量的自由基，破坏细胞膜，过氧化脂质、脂褐质等增高，导致拟衰老变化。通过连续注射D-半乳糖，可将6～8周龄的幼鼠诱导成相当于两年多的自然衰老动物，是一种较为理想的模型。已经广泛应用于衰老机制、老年疾病、抗衰老药物筛选等方面的研究。

衰老是机体代谢过程中的一个必然阶段，主要表现为机体对环境刺激的适应能力减弱以至丧失，出现多种器官组织功能的衰退并影响健康，在各器官的退行变化中脑衰老对人体的影响最大〔11〕。脂褐素是过氧化脂质分解产物，是一种长期积累在细胞内残余体，它随年龄增长而增多，因其常在老年动物细胞中存在故又称老年色素是目前公认的老化标志之一〔12〕。

本试验结果提示金莲花中荭草苷与牡荆苷各剂量组可降低小鼠脑中脂褐素的含量，以荭草苷与牡荆苷高、中剂量组作用明显，形态学观察提示，各治疗组小鼠细胞数量明显增多，细胞结构包括细胞核核膜逐渐恢复核质改善明显，提示金莲花中荭草苷与牡荆苷通过改善衰老小鼠细胞形态结构，减少脑神经细胞的衰老或凋亡，以确保其功能的发挥，从而延缓衰老，这也可能是抗衰老的机制之一。

1 江苏新医学院.中药大辞典〔M〕.上海:上海人民出版社，1977:1398.

2 曲彩红，颜 娟，田嘉铭，等.HPLC测定金莲花中三种黄酮苷的含量〔J〕. 中成药，2010;32(3):162-4.

3 颜 娟，胡海娜，田嘉铭，等.金莲花中总黄酮抗氧作用的研究〔J〕.时珍国医国药，2010;26(2):20-2.

4 杨国栋，饶 娜.金莲花中荭草苷和牡荆苷体外抗氧作用研究〔J〕.时珍国医国药，2011;22(9):2172-3.

5 孙 黎，程建贞，罗 强，等.金莲花黄酮对 K562，HeLa，Ec-109，NCI-H446细胞增殖的影响〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2009;44(5):981-3.

6 孙 黎，刘 芳，刘 华，等.金莲花黄酮对人乳腺癌细胞作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2010;29(9):1098.

7 孙 黎，罗 强.金莲花黄酮对A549细胞生长及凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;131(2):82-3.

8 曲彩红.金莲花中荭草苷兔体内药代动力学研究〔D〕.河北北方学院，2010.

9 颜 娟.金莲花中牡荆苷兔体内药代动力学研究〔D〕.河北北方学院，2010.

10 屈泽强，谢智光，王乃平，等.三七总皂营抗衰老作用的实验研究〔J〕.广州中医药大学学报，2005;22(2):130-3.

11 林 晨，沈伟哉，李药兰，等.不同溶媒中金莲花提取物体外抑菌作用的比较〔J〕.暨南大学学报(医学版)，2001;22(6):54-5.

12 Sunanuma H，Kaburani S，et al.Ameliorative effect of dietary ingestion of lycopene and matorich on learn in impairment insenescence-accelerated mice〔J〕.Food Sci Tech Res，2002;8(2):183-5.