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珙桐内生真菌Lophiostoma sp.(X1-2)石油醚部位化学成分研究

2012-08-02刘艳辉郭志勇邓张双

三峡大学学报(自然科学版) 2012年1期
关键词:珙桐石油醚碳酸

张 亮 刘艳辉 罗 薇 郭志勇 邓张双 邹 坤

(三峡大学 化学与生命科学学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室,湖北 宜昌 443002)

近年来,植物内生菌已经成为活性天然产物最重要的新来源,是药物的先导化合物的重要来源之一.在植物内生菌活性代谢产物的研究中,从微生物种类来看,主要集中在真菌的代谢产物研究上;从代谢产物类型上看,主要集中在聚酮,萜类,生物碱等类型代谢产物上[1].在上述研究过程中,忽视了对低极性成分的研究,特别是石油醚部位的化学成分的研究,但从目前的研究现状来看,不断有新的具有特殊功能的低极性脂肪酸被发现[2-3],而且脂肪酸在生命过程中扮演着非常重要的角色,如降低血液黏稠度,改善血液微循环,增强细胞活力,增强记忆力和思维能力,促进脂溶性维生素的消化和吸收等生理功能等[4],因而在该文中,通过GC-MS方法分析来自我国特有的濒危植物珙桐内生真菌Lophiostomasp.(X1-2)的石油醚部位的化学成分,为内生真菌低极性部位的合理利用提供理论和应用依据.

1 实验部分

1.1 试剂与实验仪器

X-4数字显示显微熔点仪(温度未校正),北京泰克仪器有限公司;AL204型电子天平(Mettlwr Tol EDO);N21001型旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司),GC-MS(美国Finnigan公司,TRACE GC-MS);柱色谱和薄层色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂产品,其它试剂均为分析纯.

1.2 菌种

Lophiostomasp.(X1-2)菌株是采自湖北省宜昌市大老岭国家森林公园中珙桐茎皮,经平板划线分离纯化,该菌种保存在三峡大学化学与生命科学学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室内,保存在4℃的PDA固体培养基中,经分子生物学鉴定菌株X1-2为Lophiostomasp..

1.3 菌种发酵培养

采用固态培养方式,发酵培养基为大米培养基,大米80g,水160mL,装入500mL三角瓶内,经121℃,0.1MPa,高温灭菌25min后,在超净工作台上接种,共接种40瓶,28℃静置培养40d.

1.4 提取分离

将大米培养基发酵物,用乙酸乙酯萃取至无色,用旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干,得到浓缩物120g,将浓缩物溶解拌硅胶过柱,以石油醚-丙酮-甲醇梯度洗脱,收集各组分.石油醚洗脱部分为石油醚部位.

1.5 甲酯衍生化[5]

称取经石油醚洗脱得到的样品50mg置50mL圆底烧瓶中,加φ(H2SO4)=1%的甲醇溶液2mL,于70℃水浴加热反应30min,反应完毕后,于反应液中加2mL正己烷,再加蒸馏水,充分振荡,静置分层后取上清液.用1mL正己烷洗涤上清液,将洗涤后的上清液以CaCl2干燥后,取上清液待测.

1.6 GC-MS[6]

毛细管柱DB-WAS:30m×0.25mm×0.25μm;进样口温度280℃;载气:高纯氮气;载气流量1.5 mL/min(气相色谱柱头压为1.0×105Pa),进样量:1 μL.升温程序:柱初始温度150℃,保温5min;终止温度300℃,保温3min;升温速率6℃/min;采用TIC监测方式,质谱扫描范围:29~449amu(如图1所示).

图1 内生真菌Lophiostoma sp.(X1-2)石油醚部位甲酯化GC-MS图谱

2 结果与讨论

从表1显示的结果表明,珙桐内生真菌Lophiostomasp.(X1-2)的石油醚部位的主要化学成分为达玛烷型三萜和脂肪酸,其中达玛烷型三萜类成分占其总成分的43.95%,接近于一半,而各种脂肪酸的含量约为54.54%,其它的微量成分只占总量的2%左右.其中脂肪酸以9(E)烯-十八碳酸甲酯,十八碳酸甲酯,9(Z),13(Z)二烯-十八碳酸甲酯,10(Z)烯-十九碳酸甲酯,二十四碳酸甲酯5种脂肪酸为主,其含量分别达13.61%,19.02%,11.61%,3.53%,1.42%,在脂肪酸中不饱和脂肪酸含量为28.75%,占总脂肪酸的一半还多,表明该真菌能够合成种类繁多的不饱和脂肪酸,饱和脂肪酸仅占20.44%.

表1 石油醚部位甲酯化衍生GC-MS结果

续表1 石油醚部位甲酯化衍生GC-MS结果

与其它微生物产生的脂肪酸的结构类型比较发现,一般微生物中以十六碳酸和十八碳酸及其相应的不饱和脂肪酸为主,而珙桐内生真菌Lophiostoma sp.(X1-2)却以十八碳酸和十九碳酸及其大于十九个碳的脂肪酸为主,表明真菌Lophiostomasp.(X1-2)在其脂肪酸的生源合成过程,有更多2C单元的乙酰辅酶参与脂肪酸的合成.从生物燃料的利用角度来看,更长的碳链就意味着在相同条件下能释放更多的能量.同时另外一个主要的成分达玛烷型甾烷,在乙酸乙酯部位化学成分分离中,得到证实,其中在乙酸乙酯部分化学成分中的主要成分之一是3-氢松苓酸B,从其结构来看,应该是GC-MS检测出的化合物1的在内生真菌Lophiostomasp.(X1-2)中氧化的产物[7].从上述GC-MS结果可推测,珙桐内生真菌Lophiostomasp.(X1-2)的酶系中主要以聚酮和萜类化合物的合成酶为主,因为在乙酸乙酯部位化学成分的分离中发现,该真菌的主要次级代谢额产物类型主要是萜类和脂肪酸衍生物为主(如图2~3所示).

图3 内生Lophiostoma sp.(X1-2)石油醚部位脂肪酸成分结构

随着各种不同脂肪酸的生物功能被阐明,而该内生真菌含有丰富的脂肪酸成分,值得进一步深入研究,为其开发利用不饱和脂肪酸及其提供理论依据.

(致谢:感谢三峡大学化学与生命科学学院实验中心潘家荣老师GC-MS测试工作.)

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