沙蚕金属蛋白酶体外抗凝血与溶栓作用

邓志会 孙东升 李 波 肖 微 (齐齐哈尔医学院病理生理学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目前，溶栓治疗被认为是治疗血栓性疾病最为有效的方法，极大地降低了血栓性疾病的病死率和致残率〔1〕;但这些药物也存在一些缺点，如出血、过敏反应及价格昂贵等〔2〕。因此，寻找和开发新型溶栓剂仍是治疗血栓性疾病的重要内容。生物体是溶栓剂的主要来源〔3～5〕。沙蚕是一种海洋无脊椎动物，体内含有多种纤维蛋白水解酶〔6，7〕。沙蚕金属蛋白酶(NVMP)是从海洋生物沙蚕体内分离纯化的一种新型的具有纤溶活性的金属蛋白酶，是一种分子量为28～32 kD的单链蛋白，等电聚焦电泳显示其等电点为8.0〔8〕。本研究进一步探讨其在体外的溶栓和抗凝血作用及相关机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 家兔购于我校动物室;NVMP为本实验室前期制备的冻干品;牛血凝血酶和牛血纤维蛋白原购于中国药品生物制品研究所;低分子量蛋白Marker购于Amersham Biosciences公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 抗凝血实验 家兔心脏取血。取4支灭菌小试管，分别加1 ml 0.9%NaCl(用 0.02 mol/L pH7.4 PBS 配制)，0.5、0.25、0.125 mg/ml的 NVMP(0.9%NaCl配制);然后每管加1 ml的血液，轻轻振荡、混匀，置37℃恒温水浴，定时观察血液的凝固状态。

1.3 血栓溶解率实验 家兔心脏取血，体外在培养皿内自然凝固，制成实验性血栓。将血栓切割成大致相等的4份，分别称重后依次加入4支灭菌试管内，再依次加入0.9%NaCl 1 ml，NVMP 5.0 mg/ml和 2 mg/ml(0.9%NaCl 配制)。置37℃恒温水浴，2 h后取出所有试管，小心取出血栓，并用滤纸条轻轻吸干血栓表面水分后，依次称重。重复做三次，计算血栓溶解率。溶解率=(W－G)/W×100%，W:实验前血栓重量，G:实验后血栓重量。

1.4 纤维蛋白原水解活性分析 500 μg牛血纤维蛋白原和0.5 μg 纯 化 的 NVMP 溶 解 在 500 μl 20 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中，37℃恒温孵育，在不同的时间间隔(0、1、3、5、10、30、60、120 min)取出一部分进行 SDS-PAGE 电泳分析(5%浓缩胶、10%分离胶)，观察NVMP水解纤维蛋白原各亚基的先后顺序。

1.5 纤维蛋白溶解方式 采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测NVMP溶解纤维蛋白的方式。琼脂糖-纤维蛋白平板的铺板方法参照蚓激酶的国家药品标准〔9〕:铺两个琼脂糖-纤维蛋白平板:一个为加热平板，在制作过程中不加纤溶酶原，制备好的纤维蛋白平板放在恒温干燥箱中80℃加热30 min，灭活残存在纤维蛋白原和凝血酶中的纤溶酶原和其他的促纤溶因子;另一个为不加热平板，在制作过程中加入10 mU/L的纤溶酶原200 μl不加热。每个平板打孔，加入10 μl的NVMP，37℃恒温箱中孵育过夜，测量各加样孔产生的溶圈直径。

2 结果

2.1 NVMP的抗凝血作用 加入0.9%NaCl的阴性对照组在37℃恒温孵育10 min后就已经凝固;加入0.125 mg/ml和0.25 mg/ml NVMP实验组在37℃孵育10 min时血液未凝固，在30 min时分别形成少量的小血凝块，在1 h后血凝块完全溶解，血液呈溶解状态;而加入0.5 mg/ml NVMP的实验组血液一直处于未凝固状态。表明，NVMP具有明显的抗凝血作用。

2.2 NVMP溶解血栓的效果 以兔新鲜血栓为材料，不同浓度的NVMP(0.125，0.25和0.5 mg/ml)在37℃恒温条件下，作用2 h后血栓溶解率分别为(67.5±4.7)%，(79.7±6.7)%和(85.2±8.2)%;而0.9%NaCl对照组血栓溶解率仅为(12.3±1.9)%。结果表明，NVMP具有较强的血栓溶解作用，在较低浓度下(0.125 mg/ml)对血栓仍具有较好的溶栓效果，且随NVMP浓度的增加溶解血栓的能力也逐渐增强。

2.3 NVMP水解纤维蛋白原的活性分析 将NVMP与牛血纤维蛋白原一起在37°C条件下作用，在不同的时间取出一部分进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图1。NVMP最先水解牛血纤维蛋白原的Aα链，在1 min内将其完全水解;然后牛血纤维蛋白原的Bβ链逐渐被水解，在作用30 min内水解完全;γ链是最后被水解的，在作用120 min时被完全水解。说明NVMP具有降纤作用，而且水解纤维蛋白原各亚基的速度由快到慢的顺序为Aα链、Bβ链、γ链。

图1 SDS-PAGE电泳分析NVMP的纤维蛋白原水解活性

2.4 NVMP溶解纤维蛋白的方式 使用加热和未加热两个琼脂糖-纤维蛋白平板，观察NVMP对纤维蛋白的水解作用，结果见图2。在加热和不加热的纤维蛋白平板上，NVMP均产生明显的溶圈，说明蛋白酶可以在没有纤溶酶原的条件下，直接水解纤维蛋白;同时，富含纤溶酶原的不加热平板上，蛋白酶产生的溶圈直径略大于不含纤溶酶原的加热平板，说明该蛋白酶也具有一定的激酶活性，可以通过激活纤溶酶原转变成纤溶酶的方式，间接水解纤维蛋白，这种具有激酶和纤溶酶的双重特性与蚓激酶相似，表明其具有较强的溶栓活性。

3 讨论

纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变成纤维蛋白，直接参与凝血过程;纤维蛋白原还可介导血小板聚集反应。本实验发现NVMP能够快速地水解纤维蛋白原，具有降纤作用，进而影响血液凝固过程，因此在体外表现出良好的抗凝血和抑制血栓形成的作用。NVMP的这种降纤作用是非常重要的，应用于临床时，它能够降低全血和血浆黏度，增加血流速度，改善微循环，从而抑制血栓的形成和进一步增大，预期对血栓性疾病会具有较好的临床疗效。本实验还发现，NVMP具有直接水解纤维蛋白的活性，是一种纤维蛋白溶解酶;同时还具有激活纤溶酶原转变成纤溶酶的激酶活性，因此在体外会表现出较强的纤维蛋白溶解活性，能够快速地溶解血栓。

图2 NVMP的纤维蛋白水解活性分析

对于血栓性疾病，早期(6～12 h内)的溶栓和降纤是治疗的重要手段。本研究表明，NVMP在体外具有明显抗凝血、抑制血栓形成和溶解血栓的作用，且随剂量增加作用有所增强。因此，有望将其开发成为新型的溶栓药物。

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