可吸入颗粒中金属元素对DNA的氧化性损伤

刘彦飞 ，邵龙义，于倩，李光岩，许丹，宋晓焱

(1.黑龙江科技学院 资源与环境工程学院，黑龙江 哈尔滨，150027；2.中国矿业大学(北京)地球科学与测绘工程学院，北京，100083；3.华北水利水电学院 资源与环境学院，河南 郑州，450011)

大气颗粒物对人体健康具有毒性作用[1-2]，普遍认为其毒性是过渡金属与其催化氧化生成的有机、无机自由基(ROS)及人体应激反应产生的活性氧(ROS)[3-5]之间对核物质所产生的氧化损伤和水解损伤[6]。PM10样品中提取的Fe的NO3-和SO42-盐类成分能够对沙门氏菌产生诱变[7]，且起作用的是Fe2+[8]，Cu2+，Cr3+等也能够被氧化为高价态的金属元素，他们在活性氧作用下使DNA发生脂质氧化[1,9-11]，从而引发DNA的损伤[12-13]。目前，对颗粒物中过渡金属的毒性研究主要集中在单一元素上，如颗粒物中的元素V与急性肺炎之间、元素Ni与蛋白质的渗出性之间的具有相关性[2]，水溶性Zn可以对DNA产生氧化损伤[13]、且与城市心脏病的发病率之间具有相关性[14]等，而且所关注的大多为人为源元素[15]。通常，水溶性Zn2+的毒性明显小于水溶性的Fe，Cu和Ni等[16]，但另外的实验结果表明，细胞中的Zn的浓度增加或降低，均可导致Cr6+对DNA的氧化损伤能力的变化[17]。这表明，颗粒物中的金属元素之间可能会产生某种协同损伤作用[18]。另外，颗粒物中存在着一定量的稀土元素，具有遗传毒性[19]，但其在颗粒物中所起到的毒性作用还不清楚。本文作者采用等离子质谱(ICP-MS)测定了PM10和PM2.5全样和水溶样中58种元素，采用质粒DNA评价法评价了样品的生物活性，并采用SPSS软件分析PM样品的生物活性(本文指颗粒物对于生物物质——质粒DNA产生的损伤效应)与样品中金属离子之间的关系，以判断颗粒物中的主要相关性元素及其作用行为。

1 材料与方法

1.1 采样及制样

设置3个采样点：市区采样点设置在市区内的黑龙江科技学院嵩山校区主楼5楼顶；近郊区采样点设置在松花江北岸黑龙江科技学院江畔宾馆5楼顶；背景点设在哈尔滨市第二水源地。采用Negretti切割器，流量为100 L/min；滤膜为纤维膜，连续采集20～30 d，然后将滤膜置于硅胶干燥器中，得质量恒定后，小心剥离膜表面的颗粒层。

准确称取一定量的颗粒样品约4 mg，装入10 mL离心管中，同时加入HPLC级H2O配制成颗粒物浓度为1 mg/mL，并置于旋涡振荡器上缓慢振荡6 h。然后，将振荡后的样品分为4份。第1份用于颗粒物全样质粒DNA实验；第2份经过高速离心(13 000 r/min)60 min后吸取上清液，用于颗粒物水溶样质粒DNA实验；第3份也经过60 min高速离心后，吸取上清液用于颗粒物中水溶组分的ICP-MS实验；第4份做全样的ICP-MS实验。

1.2 ICP-MS和质粒DNA分析

将制备好的用于ICP-MS水溶样和全样样品各1 mL分别加入0.5 mL铑(50×10-9)标准溶液和5 mL(2%，体积分数)稀硝酸溶液，然后进行ICP-MS(PerkinElmer Elan 5000)分析，检测22个样品中的58种微量元素。

依据质粒DNA评价法[18]，对配制不同剂量(质量浓度，μg/mL)的颗粒物样品的全样和水溶样对质粒DNA( μX174-RF)进行损伤实验，并通过凝胶电泳和紫外成像系统(SynopticsLtd, Cambridge, UK)、Syngene-Genetools程序统计样品对质粒DNA损伤率，最后应用线性回归的方法获取样品的TD40值(TD40值为造成40%的DNA损伤所需的颗粒剂量，TD40值越小，颗粒物的生物活性越高)。

2 结果

2.1 PM10和PM2.5水溶样和全样对质粒DNA的损伤

使用质粒DNA评价法研究了哈尔滨市区和郊区、背景点采集的PM10和PM2.5样品的水溶样和全样的生物活性，样品信息见表1，经线性回归分析获得的样品TD40值见表2和表3。

表2和表3表明，PM10和PM2.5水溶样和全样对质粒DNA都具有活性，而且其损伤的TD40值的变化范围较大，反映了样品的时空变化导致其TD40值的变化较大；最小值为67.9 μg/mL，最大值为1 570 μg/mL，且大多数样品的全样较水溶样具有更强的损伤能力(TD40值较小)，但也有部分样品的损伤能力正好相反。这表明，PM的生物活性主要与其来源和性质有关。

表1 样品信息Table1 Sample information

表2 哈尔滨市市区、郊区和清洁对照点采集的大气颗粒物水溶样对质粒DNA的损伤Table2 Quantification of oxidative DNA damage induced by soluble fraction of airborne PM samples collected in Harbin urban area, a suburban sites and a clean air area TD40/(μg·mL-1)

表3 哈尔滨市市区、郊区和清洁对照点采集的大气颗粒物全样对质粒DNA的损伤Table3 Quantification of oxidative DNA damage induced by airborne PM whole samples collected in Harbin urban area, a suburban sites and a clean air area TD40/(μg·mL-1)

2.2 PM10和PM2.5中微量元素的富集因子分析

采用双重归一化的富集因子法方法，判断元素在大气颗粒物中的富集程度和来源[20]。其富集因子F为：

式中：(Xi/XR)颗粒物为即颗粒物中待考元素i与参比元素R的相对浓度；为地地中相应元素i(中国土壤元素含平均值)和R的平均丰度求得的相对浓度，参比元素R为Al[21]。当某种元素的F值大于10时，该元素被富集与人为污染源有关[22]。经实测PM中58种元素含量及对计算结果统计，不同地区和季节所采集的PM样品中，Pb，Sb，Zn，Cd，Sn，Tl，Te，Bi，V，As，Ag，In，Mo，Cu，Ga，Cr，W等17种元素的富集因子平均值大于10，即这些颗粒主要来自人为污染。

2.3 PM10和PM2.5水溶样TD40值与样品微量元素之间的回归分析

利用SPSS.11软件对各样品的TD40值与其所含58种微量元素之间进行多元线性分析，得出回归方程(2)和(3)：

式中：TS和TW为水溶样和全样的TD40值；M为常量；K为系数；b为质量摩尔浓度，μmol/g。

除了Y为第Ⅲ副族元素外，式(2)方程中其他相关性元素都是镧系元素，且均为稀土元素；与方程(2)相比，方程(3)中的相关元素明显增多，其中Cs，In，Cd为主、副族元素，其他均为过渡金属元素(包括稀土)。表4和表5所示分别为哈尔滨市PM样品水溶样和全样回归方程中相关性元素的ICP-MS实测值。根据其富集因子可知，除了Pb，W，Cd，In 4种元素为人来源外，其余均为自然源。由此可见，全样品中的生物活性元素可来源于人为源和自然源，而且涵盖了过渡金属、碱金属或其他主族类，但稀土金属对颗粒物的生物活性影响显著。

表4 哈尔滨市可吸入颗粒物中5种元素的质量分数Table4 Mass fraction of five elements in PM samples collected in Harbin μg/g

表5 哈尔滨市可吸入颗粒物全样中13种元素的质量分数Table5 Mass fraction of thirteen elements in whole PM samples collected in Harbin μg/g

经方差分析与检验，水溶样TD40值与La，Y，Lu，Ho，Sm之间、全样TD40值与Cs，La，Tb，Ni，Mn，Yb，Er，Pb，W，Tm，Cd，In，Gd之间有直线关系。水溶样中，TD40与元素Y正相关，即随着元素Y浓度的增加，颗粒的生物活性将降低，而在对损伤质粒DNA的作用行为上，Y拮抗La，Lu，Ho，Sm的损伤作用；在全样中，TD40与全样中元素Cs，La，Mn，Pb，Tm，Gd浓度呈正相关，与元素Tb，Ni，Yb，Er，W，Cd，In浓度负相关，在损伤行为上，元素Cs，La，Mn，Pb，Tm，Gd协同拮抗元素Tb，Ni，Yb，Er，W，Cd，In的损伤行为。

3 讨论

3.1 可吸入颗粒TD40回归值的误差分析

应用ICP-MS测试数据，根据式(2)和(3)，可回归计算出水溶样和全样对DNA损伤的TD40值及其与实测值间的相对误差，结果见表6。从表6可知：在PM全样中，除了16号样品的回归值与实测值间的相对误差较大外，其他样品的相对误差都较小，表现出较好的拟合效果；而在PM水溶样中，回归值与实测值相对误差较全样的大。但从总体上看，样品的实测值和回归值计算值相差不大，表明回归方程的计算结果比较可信。

3.2 金属元素对质粒DNA损伤能力分析

金属元素对质粒DNA损伤，主要是以八面体水合离子对DNA的脱氧核糖糖环、碱基进行攫氢氧化和直接进攻磷酸二酯键引起DNA的水解2种形式进行的。

一般地，单价态金属阳离子优先与核酸的磷酸基配位，但作用位置选择性不强，而二价阳离子与磷酸基和碱基都能配位，特别是过渡金属有d轨道，可与DNA 碱基直接键合。在生理酸碱度和一定H2O2浓度下，Fe2+，V4+，Cr3+，Cu2+，Co2+，Ni2+，Pb2+，Cd2+等均能对8-羟基脱氧嘌呤的产生损伤，而且Fe2+产生羟基自由基能力远大于其他金属的能力[23]；过渡金属与DNA之间形成八面体金属配合物，并使DNA碱基产生氧化和断裂[24]。过渡金属还易以插入的方式或静电结合的方式与DNA的含O基团结合，特别是稀土离子具有更小的离子半径、较高的电荷及离子势，其结合和损伤能力更强。

一般认为，稀土金属都有遗传毒性[25-27]。低浓度的钇等离子可以强烈抑制人体红细胞膜过氧化作用，高浓度时具有明显的促进作用[28]。钇和镨的氯化物均可使淋巴细胞DNA受损[29]。Y能够对大鼠脑组织和外周血淋巴DNA产生损伤[30-31]，在高浓度喂养下，子代小鼠脑、内脏组织中的Cu，Cd，Pb含量没有变化，而其组脑组织中稀土Y含量、脾脏中Se含量却显著增加，肝、肾中Se也有略有增加趋势；低浓度喂养时，脑组织中Cu，Cd，Pb含量无明显变化、而脾脏中Se的含量显著增加，表明稀土钇可进入幼鼠脑组织中、稀土的长期摄入不会增加Cd和Pb等有害元素的摄入和吸收，而且稀土元素Y的抗氧化性可能与增加Se的吸收有关[32]。因此，Y虽然具有一定的遗传毒性，但Y与DNA结合后，可能一定程度上抑制了其他元素与DNA的结合和断裂作用，从而在PM水溶样(低浓度)中的作用行为表现为拮抗。

表6 哈尔滨市可吸入颗粒DNA氧化损伤TD40回归值的相对误差Table6 Relative error study on regression value of inhalable particles DNA oxidative damage TD40 in Harbin

对于其他镧系金属，低浓度的Ce(No3)3能够对DNA产生损伤[33]；低剂量氯化钬染毒时，不能使小鼠肝脏细胞DNA凋亡(apoptosi)，高剂量染毒时，小鼠肝脏细胞凝胶电泳有弥散性拖尾现象[34]；对大鼠进行镧暴露，子代大鼠脑组织发生脂质过氧化损伤[35]；Ce(Ⅲ)和 Nd(Ⅲ)对脾脏细胞氧化损伤和毒性作用超过Ce(Ⅲ)和La(Ⅲ)[36]，这表明稀土元素之间具有协同损伤作用。在本研究中，水溶样和全样中La的作用正常相反，在低浓度(水溶样)时为表现为损伤作用，而在高浓度(全溶样)时表现为拮抗作用，进一步研究结果表明，由于竞争结合作用，各种金属的作用行为与其浓度作用范围有关。

4 结论

(1)受时空变化影响，哈尔滨市PM10和PM2.5的生物活性变化较大，其TD40值最小为67.9 μg/mL，最大为1 570 μg/mL；PM的生物活性主要与其来源和性质有关。

(2)PM10和PM2.5水溶样和全样的TD40值与样品中部分微量元素之间具有线性关系，水溶样中元素Y拮抗La，Lu，Ho，Sm的协同损伤作用。全样中元素Cs，La，Mn，Pb，Tm，Gd协同拮抗Tb，Ni，Yb，Er，W，Cd，In的协同损伤作用。

(3)过渡金属、碱金属或其他主族金属元素都具有较强的生物活性作用，其中稀土元素对颗粒物的生物活性具有显著影响，而且不同金属的作用行为与其浓度有关。

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