三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠IFN－γ基因表达的调控*

朱晓芳，王晓冰，陈培荣，嘉 婷，朱小春

(温州医学院附属第一医院风湿免疫科，浙江 温州 325000)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因未明的累及多系统的慢性反复性自身免疫疾病。SLE病人与动物模型中干扰素γ(interferon－gamma，IFN－γ)的表达增加是导致疾病发展的重要机制之一［1－2］。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中药砒霜的主要成分，已成功应用于急性早幼粒细胞白血病及一些实体肿瘤的临床治疗［3］。国外研究［4］及我们的前期研究［5－6］均证实ATO是一种治疗SLE很有前景的药物，但其具体机制尚待进一步研究。本文通过运用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法研究ATO对狼疮鼠IFN－γ基因表达的调控，为ATO治疗SLE的作用机制提供重要的实验依据。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂和器材 ATO、植物血凝素P(phytohemagglutinin－P，PHA－P)和37%的甲醛(252549)购自Sigma;抗RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNAP II)抗体、ChIP试剂盒(#17－371)购自Millipore;乙酰化组蛋白H4(acH4)抗体(ab15823)和乙酰化组蛋白H3(acH3)抗体(ab10812)购自Abcam;重组人白细胞介素－2(interleukin－2，IL－2)购自上海华新生物高技术有限公司;RPMI－1640和胎牛血清(FCS)购自Gibco;小鼠淋巴细胞分离液(北京索莱宝);Trizol购自 Invitrogen;RT－PCR试剂盒、SYBR Green real－time PCR试剂盒购自Toyobo;小鼠IFN－γ ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司;超声波细胞破碎仪JY92－Ⅱ购自宁波新芝;荧光定量PCR仪采用ABI的StepOne Plus Real－Time PCR System。实验中所用引物由Invitrogen合成。

1.2 动物 20周龄 MRL/lpr狼疮鼠15只，体重36～38 g;20周龄 C57BL/6J小鼠 28只，体重20～22 g，购自中国科学院上海实验动物中心，饲养在温州医学院动物实验中心SPF级动物房。

2 方法

2.1 细胞培养与实验分组 颈椎脱臼法处死小鼠后，无菌条件下取脾脏，用200目筛网轻轻研磨脾脏过滤成单细胞悬液，采用密度梯度离心法自脾脏单细胞悬液中分离小鼠淋巴细胞，用10%FCS－RPMI－1640重悬，调整细胞浓度为2×109/L，37℃、5%CO2孵箱培养1～2 h后观察细胞生长情况，排除细菌生长，台盼蓝染色法测定细胞存活率＞98%。加入PHA－P(终浓度20 mg/L)和IL－2(终浓度106IU/L)，孵箱继续培养48 h后随机分为2组:(1)PBS组:为空白对照组;(2)ATO 组:1.0 μmol/L ATO 作为实验组，共同培养24 h。

2.2 ELISA法测定各组培养上清液IFN－γ的浓度 收集细胞悬液于Eppendorf管，离心后吸取细胞上清液置于－80℃冰箱保存待测。严格按试剂说明书操作，显色后在全自动酶标仪上450 nm波长处读取A值，通过绘制标准曲线求出指标含量。

2.3 实时荧光定量PCR法检测各组细胞IFN－γ mRNA的表达 用Trizol法抽提RNA，测RNA浓度后取2 μg的RNA，采用日本东洋纺(Toyobo)的 RT－PCR试剂盒，依照说明书进行逆转录反应。以β－actin为内参照，采用实时荧光定量PCR进行IFN－γ和β－actin产物扩增及结果分析。IFN－γ引物序列:上游为5'－ggaaccctctcccttcaatgt－3';下游为5'－ctccacaatagccttcagtgc－3'。β－actin引物序列:上游为5'－gagaccttcaacaccccagc－3';下游为 5'－atgtcacgcacgatttccc－3'。反应体系:SYBR－Green Master Mix 10 μL，Plus 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，DNA 模板 2 μL，加灭菌双蒸水补至总体积20 μL。PCR循环条件设置:94℃变性10 min后，94℃ 20 s，60℃ 1 min，扩增50个循环，反应完成后再于95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s绘制熔解曲线。根据Livak和Schmittgen设计的阈值法测定目的基因的相对表达水平，目的基因量 =2－ΔΔCt，将 C57BL/6J小鼠PBS组(C57 PBS)作为样本校正，其表达水平设置为1，ΔΔCt = ［Ct目的基因(其它实验组)－Ct内参照(其它实验组)］－［Ct目的基因(C57 PBS)－ Ct内参照(C57 PBS)］。

2.4 ChIP 主要步骤:(1)蛋白－DNA交联和裂解细胞:取10 mL细胞悬液(约2×107个细胞)，加入37%甲醛使之终浓度为1%，37℃孵育10 min。加入甘氨酸终止交联反应，洗涤2次。离心去上清后加入1 mL含蛋白酶抑制剂的SDS裂解液重悬细胞沉淀，冰上孵育10 min。(2)超声断裂染色质:按优化好的条件(200 W，每次超声15 s，间隔30 s，共10次)断裂细胞裂解液中的染色质，使DNA的长度主要分布在200～1000 bp，4℃离心保留上清。(3)免疫共沉淀:超声处理后的溶液中加入含蛋白酶体抑制剂的ChIP稀释缓冲液，用蛋白G－琼脂糖小珠进行预清除，离心后吸取1%上清留作input溶液，将剩余的上清分装，每管1.0 mL，分别加入特异性抗体(抗 RNAPⅡ抗体每管 5.0 μg，抗 acH3 抗体每管 3 μg，抗 acH4 抗体每管 2.5 μg)及阴性对照抗体(正常小鼠IgG每管1.0μg)，4℃摇床上孵育过夜。第2 d溶液中加入蛋白G－琼脂糖小珠吸附免疫沉淀复合物，离心去上清，依次用低盐、高盐、氯化锂和TE缓冲液清洗蛋白G－琼脂糖小珠。(4)洗脱免疫沉淀复合物:配制新鲜洗脱液用于洗脱免疫沉淀复合物，同时在装有Input溶液的管中加入相同体积的洗脱缓冲液。(5)蛋白－DNA复合物解交联:加入5 mol/L NaCl使之终浓度为0.02 mol/L，65℃水浴孵育过夜。(6)用DNA纯化柱回收DNA。

2.5 半定量PCR分析ChIP产物 半定量PCR分析ChIP产物，用于扩增IFN－γ基因启动子的引物如下:上游引物为5'－tcagctgatcctttggaccc－3'，下游引物为5'－ctcagagctaggcgcagg－3'。反应体系:10×PCR buffer 2 μL、2 mmol/L dNTP 2 μL、25 mmol/L MgSO40.8 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、KOD Plus 0.4 μL、DNA 模板 2 μL，加灭菌双蒸水补至总体积 20 μL。PCR循环条件设置:94℃变性3 min后，94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增32个循环，然后行72℃ 2 min。最后将PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。

2.6 实时荧光定量PCR分析ChIP产物 实时荧光定量PCR分析ChIP产物，用于扩增的IFN－γ基因启动子引物如下:上游为 5'－tttcagagaatcccacaagaatg－3'，下游为5'－tcgggattacgtattttcacaag－3'。采用ABI公司的StepOne Plus Real－Time PCR System对CHIP产物分析，反应体系:SYBR－green master mix 10 μL、Plus 2 μL、上下游引物(10μmol/L)各 1 μL、DNA模板 2 μL，加灭菌双蒸水补至总体积20 μL。PCR循环条件设置:94℃变性10 min后，94℃20 s，60℃ 1 min，扩增50个循环，反应完成后再于95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s绘制熔解曲线，分析方法参考文献［7］和ChampionChIP qPCR Primers说明书介绍的方法，用ΔΔCt值进行相对定量，各实验组均以C57BL/6J小鼠PBS组(C57 PBS)为对照组，其表达水平设置为1，计算其它实验组较对照组C57 PBS组的倍数改变。

3 统计学处理

以SPSS 17.0统计学软件进行分析。数据以均数±标准()表示，进行方差齐性检验，根据样本的性质采用单因素方差分析、Dunnet's T3检验。以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 ELISA法测定上清液中IFN－γ浓度的结果

(1)MRL/lpr狼疮鼠PBS组IFN－γ的分泌高于C57BL/6J小鼠PBS组(P＜0.01);(2)在 MRL/lpr狼疮鼠中，与PBS组相比，ATO组IFN－γ的分泌下降(P＜0.01);(3)在 C57BL/6J小鼠中，PBS组和ATO组之间IFN－γ的浓度无差异，见表1。

表1 MRL/lpr小鼠和C57BL/6J小鼠细胞上清液中IFN－γ的浓度Table 1.The expression of IFN － γ in the supernatants of the cells from MRL/lpr mice and C57BL/6J mice(ng/L..n=6)

表1 MRL/lpr小鼠和C57BL/6J小鼠细胞上清液中IFN－γ的浓度Table 1.The expression of IFN － γ in the supernatants of the cells from MRL/lpr mice and C57BL/6J mice(ng/L..n=6)

＊＊P ＜0.01 vs MPL/lpr PBS group.

PBS 273.005 ±18.824 168.462 ±11.779＊＊ATO 191.731 ±16.522＊＊ 160.914 ±14.526＊＊

2 超声波断裂染色质

按优化好的条件(200 W，每次超声15 s，间隔30 s，共10次)断裂细胞裂解液中的染色质，切割后的DNA片段主要分布在200～1000 bp，基本符合ChIP的要求，见图1。

Figure 1.The segments of crosslinked DNA cut by ultrasound were mainly 200 ～1000 base pairs in size.图1 超声波切割染色质DNA琼脂糖凝胶电泳图

3 半定量PCR分析ChIP结果

半定量PCR分析各组细胞IFN－γ启动子区acH3、acH4及启动子区结合RNAPⅡ的水平。超声打断之后，以各组input DNA为模板，以IFN－γ为引物，通过调整模板量，重复验证以最后在各组的input DNA扩增出相同条带时的模板量作为最后抗体处理过的DNA样本做PCR所需的模板量，并且将PCR产物稀释2倍，琼脂糖凝胶电泳显示。与正常C57BL/6J小鼠相比，MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞IFN－γ启动子区acH3和acH4的水平升高，更多的RNAPⅡ被富集到IFN－γ启动子区域;ATO能降低MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞IFN－γ基因启动子区域acH3和acH4的水平，减弱RNAPⅡ与IFN－γ启动子区域的结合，而对正常C57BL/6J小鼠无明显影响，见图2。

4 实时荧光定量PCR分析ChIP结果及IFN－γ mRNA的表达情况:

Figure 2.Identification of ChIP by semiquantitative PCR and agarose gel electrophoresis.图2 半定量PCR验证ChIP的琼脂糖凝胶电泳图

(1)MRL/lpr狼疮鼠PBS组IFN－γ mRNA的表达高于C57BL/6J小鼠PBS组(P＜0.05)，并且IFN－γ启动子区acH3、acH4的水平及启动子区域富集RNAPⅡ水平高于 C57BL/6J小鼠 PBS组(均 P＜0.01);(2)在 MRL/lpr狼疮鼠中，与 PBS组相比，ATO组IFN－γ mRNA的表达下降(P＜0.05)，IFN－γ基因启动子区域acH3、acH4的水平及启动子区域富集RNAPⅡ水平也下降(均P＜0.01);(3)在C57BL/6J小鼠中，PBS组和ATO组之间以上指标均无差异，见图3。

Figure 3.All samples were divided and analyzed by quantitative real－time PCR －based ChIP to measure the degree of histones H3(A)and H4(B)acetylation at IFN－γ promoter regions and the combination of RNA polymeraseⅡto IFN －γ promoter(C).Quantitative real－time PCR was also used to measure the levels of IFN－γ mRNA(D)..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs each other.图3 实时荧光定量PCR分析ChIP结果及IFN－γ mRNA的表达

讨 论

SLE是一种常见的自身免疫性疾病，其病因和发病机制尚未完全阐明。处于活动期的SLE病人全血细胞中IFN－γ的分泌量明显高于正常人，并且分泌水平与SLEDAI(SLE活动性指标)呈不同程度的正相关［1］。Hasegawa等［2］认为循环和组织 IFN － γ的表达增加是导致SLE疾病发展和肾脏损害的重要机制。越来越多的研究表明下调IFN－γ水平可作为治疗 SLE 的新靶点［8－9］。Bobe 等［4］提出:ATO 能下调 MRL/lpr狼疮鼠血清 IFN－γ的水平，减少MRL/lpr小鼠皮肤损害和肾小球免疫复合物的沉积，极大地延长生存时间。这与我们的前期体内研究［5－6］相一致。

我们的前期研究发现1.0 μmol/L ATO体外作用MRL/lpr狼疮鼠24 h是最佳作用时间和作用浓度。本研究发现，L/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞IFN－γ的分泌水平及其mRNA的表达高于正常C57BL/6J小鼠;ATO能下调MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞IFN－γ的分泌水平及其 mRNA的表达，而对正常C57BL/6J小鼠无明显影响。ATO通过何种机制下调MRL/lpr狼疮鼠IFN－γ mRNA的表达，从而降低IFN－γ的分泌水平是本研究的重点。

组蛋白乙酰化修饰是基因转录调控的重要机制。当组蛋白乙酰化水平升高时，染色质处于活化或开放状态，此时核小体之间的致密度很低，允许了转录复合体的进入，从而导致基因的转录，反之，则阻止了基因的转录［10－11］。Long 等［12］发现组蛋白的高乙酰化是导致IFN－γ基因转录表达量增加的主要机制，而组蛋白的乙酰化水平下降时，IFN－γ基因转录表达量也下调。ChIP是一种能真实反映细胞内DNA结合蛋白与基因组DNA相互作用的实验技术，目前常用于研究组蛋白修饰，转录因子和染色质调控复合物与 DNA的相互作用［13］。本研究运用ChIP技术发现MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细IFN－γ启动子区acH3、acH4的水平较正常C57BL/6J小鼠升高，ATO能降低MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞IFN－γ基因启动子区域acH3和acH4的水平，而对正常C57BL/6J小鼠无明显影响。我们由此推测，MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞高表达IFN－γ mRNA可能与其基因启动子区域acH3、acH4的水平升高有关，而ATO可能通过下调IFN－γ启动子区域acH3、acH4的水平，阻碍了转录复合体的进入，从而阻止IFN－γ基因的转录，减少IFN－γ mRNA的表达。

RNAPⅡ与相应转录因子组成mRNA的转录复合体在基因的转录中起着重要的作用［14］。在ChIP应用抗RNAPⅡ抗体，了解RNAPⅡ与基因启动子区结合情况，能较好地反映mRNA的转录情况:转录激活时RNAPⅡ与基因启动子区域的结合水平升高，反之，二者结合水平下降［15］。本研究发现与正常C57BL/6J小鼠相比，更多的RNAPⅡ被富集到MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞IFN－γ的启动子区域，ATO能减弱MRL/lpr狼疮鼠RNAPⅡ与IFN－γ启动子区域的结合，而对正常C57BL/6J小鼠无明显影响。因此，ATO可能通过减弱MRL/lpr狼疮鼠RNAPⅡ与IFN－γ启动子区域的结合而阻止IFN－γ基因的转录。

综上所述，通过MRL/lpr狼疮鼠这个模型我们可以推测ATO可能通过下调MRL/lpr狼疮鼠IFN－γ基因启动子区域acH3和acH4的水平，减弱RNAPⅡ依赖的转录，从而降低IFN－γ mRNA的表达，下调IFN－γ的分泌水平。但ATO对转录因子如STAT4、T－bet以及组蛋白的其它修饰仍待进一步研究。

［1］Lit LC，Wong CK，Tam LS，et al.Raised plasma concentration and ex vivo production of inflammatory chemokines in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Ann Rheum Dis，2006，65(2):209 －215.

［2］Hasegawa K，Hayashi T，Maeda K.Promotion of lupus in NZB×NZWF1mice by plasmids encoding interferon(IFN)－γ but not by those encoding interleukin(IL)－4［J］.Comp Pathol，2002，127(1):1 －6.

［3］任玮玮，李 弘，张 洹.三氧化二砷对肝癌细胞生长抑制作用差异性探讨［J］.中国病理生理杂志，2004，20(7):1179 －1182.

［4］Bobé P，Bonardelle D，Benihoud K，et al.Arsenic tri oxide:a promising novel therapeutic agent for lymphoproliferative and autoimmune syndromes in MRL/lpr mice［J］.Blood，2006，108(13):3967 －3975.

［5］王晓冰，陈培荣，张 挺，等.三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠IFN－γ、IL－4表达和Th1/Th2平衡的影响［J］.细胞生物学杂志，2008，30(4):509 －514.

［6］Xia XR，Xu H，Zhu XC.Effects of arsenic trioxide on survival rate and autoimmune responses of lupus mice［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2007，21(6):482 －486.

［7］Pace BS，Qian XH，Sangerman J，et al.p38 MAP kinase activation mediates γ－globin gene induction in erythroid progenitors［J］.Exp Hematol，2003，31(11):1089 －1096.

［8］Lawson BR，Prud'homme GJ，Chang Y，et al.Treatment of murine lupus with cDNA encoding IFN － γR/Fc［J］.J Clin Invest，2000，106(2):207 －215.

［9］Shirota H，Gursel M，Klinman DM.Suppressive oligodeoxynucleotides inhibit Th1 differentiation by blocking IFN－ γ and IL －12 － mediated signaling［J］.J Immunol，2004，173(8):5002 －5007.

［10］Backs J，Olson EN.Control of cardiac growth by histone acetylation/deacetylation［J］.Circ Res，2006，98(1):15－24.

［11］Urnov FD，Wolffe AP.Chromatin remodeling and transcriptional activation:the cast(in order of appearance)［J］.Oncogene，2001，20(24):2991 －3006.

［12］Long M，Slaiby AM，Wu S，et al.Histone acetylation at the Ifng promoter in tolerized CD4 cells is associated with increased IFN－γ expression during subsequent immunization to the same antigen［J］.J Immunol，2007，179(9):5669－5677.

［13］李敏俐，王 薇，陆祖宏.ChIP技术及其在基因组水平上分析DNA与蛋白质相互作用［J］.遗传，2010，32(3):219－228.

［14］Sims RJ3rd，Belotserkovskaya R，Reinberg D.Elongation by RNA polymerase II:the short and long of it［J］.Genes Dev，2004，18(20):2437 －2468.

［15］Sandoval J，Rodríguez JL，Tur G，et al.RNAPol－ ChIP:a novel application of chromatin immunoprecipitation to the analysis of real－time gene transcription［J］.Nucleic Acids Res，2004，32(11):e88.