ACE/ACE2在AGT－REN双转基因高血压小鼠肾组织的表达变化及意义*

刘英超，王银环，耿 菲，王建军，王建辉，张 伟，杨秀红，△，秦 川

(河北联合大学基础医学院1生理教研室，2机能实验室，河北 唐山 063000;3中国医学科学院实验动物研究所，北京 100021)

目前多数学者认为高血压是一种多基因遗传性疾病，严重时可伴有肾损伤。研究发现，肾素－血管紧张素系统(renin－angiotensin system，RAS)在高血压的发生发展过程中发挥着重要作用［1］。传统观点认为，由血管紧张素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)、血管紧张素转化酶(angiotensin－converting enzyme，ACE)、血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)以及血管紧张素II 1型受体(AT1R)组成的缩血管通路是RAS的主要组成成分。ACE可分解AngⅠ生成AngⅡ，AngⅡ与AT1R结合，具有促进细胞增殖、增加水钠潴留、强烈收缩血管等作用。ACE催化的缩血管、通路过度激活参与了高血压的发生发展，然而ACE抑制剂对高血压的治疗效果文献报道不一［2］。近年来，随着血管紧张素转化酶2(angiotensin－converting enzyme 2，ACE2)的发现及深入研究［3－4］，人们认识到RAS中还存在着另外一条舒血管通路，即AngⅡ－ACE2－Ang(1－7)－Mas受体这一通路。ACE2分解AngⅡ，生成 Ang(1－7)，Ang(1－7)与 Mas受体结合，具有抗增殖、调节水电解质平衡、舒张血管、降低血压等作用。有文献报道称，高血压的发生发展也与ACE2催化的舒血管通路活性降低有关［5］。本文研究了ACE/ACE2在血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)－肾素(renin，REN)双转基因高血压小鼠肾组织中的表达变化，进而探讨RAS稳态失衡在高血压发病和肾组织损伤中的意义。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 实验分为4组，随机选取野生型(wild type，WT)小鼠、AGT转基因小鼠、REN转基因小鼠以及AGT－REN双转基因小鼠各6只，均为雄性C57小鼠，10月龄。其中AGT转基因小鼠和REN转基因小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供。2种转基因小鼠分别是利用人AGT基因和REN基因启动子构建重组质粒，经酶切、纯化获得目的基因，通过显微注射方法建立的人AGT转基因小鼠和人REN转基因小鼠。AGT－REN双转基因小鼠由AGT、REN转基因小鼠交配繁殖所得。所有动物均在河北联合大学实验动物中心清洁级动物房饲养繁殖。

1.2 主要仪器 BL－420系统(成都泰盟科技有限公司);酶标仪(Model 680，Bio－Rad);电泳仪(ECP3000，北京六一仪器厂);BI2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司);光学显微镜(Olympus)。

1.3 主要试剂 β－Actin和 ACE2抗体购自Abcam，ACE抗体购自Santa Cruz;免疫组化II抗购自北京中杉金桥生物技术公司;RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western封闭液、Western抗兔Ⅱ抗、ECL发光剂以及显影定影剂均购于上海碧云天生物技术研究所。其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 颈总动脉插管测血压 10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠后，将其固定在鼠板上，切开颈部皮肤，分离组织，找到并分离颈总动脉，进行插管。插管成功后，开启BL－420系统，进行血压监测1 h。

2.2 HE染色观察肾组织病理改变 成功监测血压后，颈动脉放血处死小鼠，迅速取出左侧肾脏置于10%甲醛中固定。之后常规方法脱水、包埋、切片、HE染色，显微镜下观察。

2.3 免疫组化观察肾组织ACE/ACE2表达 将肾组织石蜡切片常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，3%过氧化氢室温下孵育10 min，枸橼酸缓冲液中高温修复2～3 min，自然冷却至室温。滴加Ⅰ抗，37℃孵育1.5 h，PBS冲洗5 min×3次，加入Ⅱ抗试剂Ⅰ37℃孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次，加入Ⅱ抗试剂Ⅱ37℃孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，脱水、透明、封片，显微镜下观察。利用 BI2000医学图像分析系统进行分析，测定吸光度值，进行统计分析。

2.4 Western blotting观察肾组织ACE/ACE2表达右侧肾脏取出后，称取100 mg放入装有RIPA裂解液的玻璃匀浆器中研磨，离心后取上清测定蛋白浓度。SDS－PAGE电泳分离蛋白后，转至NC膜上。Western封闭液封闭2 h后分别加入兔抗ACE2、βactinⅠ抗(Abcam，1∶1000 稀释)以及ACEⅠ抗(Santa Cruz，1∶200)，4 ℃孵育过夜。TBST 清洗后，加入羊抗兔Ⅱ抗(碧云天公司，1∶5000稀释)，室温孵育30 min。TBST清洗后，滴加ECL发光剂，进入暗室曝光、显影、定影。实验结果采集之后，利用ImageJ图像处理软件对条带进行分析，测定灰度值，以各组蛋白所得灰度值与β－actin灰度值的比值作为最终结果，进行统计分析。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件分析实验数据。数据以均数±标准差()表示。组间比较应用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 血压检测结果

观察小鼠动脉插管后20 min、40 min、60 min平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)及脉压差(pulse pressure，PP)值。结果显示:AGT转基因小鼠与野生小鼠相比，MAP无明显差异(P＞0.05);REN转基因小鼠与野生小鼠相比，MAP降低约15 mmHg(P＜0.05);AGT－REN双转基因小鼠与其它3组比较，MAP明显升高约 30 mmHg(P ＜0.05)。AGT、REN转基因以及AGT－REN双转基因小鼠PP值与野生小鼠相比均明显升高(P＜0.05)，见表1。

表1 不同基因型小鼠血压测定结果Table 1.The results of blood pressure in different transgenic mice(mmHg..n=6)

表1 不同基因型小鼠血压测定结果Table 1.The results of blood pressure in different transgenic mice(mmHg..n=6)

*P ＜0.05 vs other groups;△P ＜0.05 vs WT mice.

WT 73.81 ±9.68 3.19 ±0.56 77.03 ±9.30 2.91 ±0.30 73.14 ±8.38 3.24 ±0.56 AGT 72.00 ±8.65 7.96 ±2.73△ 70.66 ±9.24 8.32 ±3.23△ 70.15 ±9.25 8.43 ±2.75△REN 61.63 ±7.53△ 6.91 ±2.91△ 57.51 ±10.76△ 7.45 ±2.23△ 56.07 ±9.56△ 7.65 ±3.04△AGT －REN 112.05 ±9.29* 9.20 ±2.64△ 106.66 ±10.24* 8.81 ±3.14△ 104.38 ±10.77* 8.97 ±1.68△

2 HE染色结果

HE染色结果显示:与野生小鼠相比，AGT和REN转基因小鼠肾组织均未见明显病理改变(因与野生小鼠相比无显著差异，图片未提供);而AGTREN双转基因小鼠肾组织可见肾小动脉呈增生性内膜炎改变，内膜显著增厚，管腔狭窄，管壁增厚，纤维素样坏死，肾小球纤维化、玻璃样变，肾小管代偿性扩张，可见大量透明管型。肾组织出现了典型的恶性高血压肾损伤病理表现，见图1。

Figure 1.The pathological changes of the kidneys(HE staining，×100).A:WT mice;B:AGT －REN mice.图1 肾脏HE染色结果

3 免疫组化染色结果

免疫组化染色结果显示，ACE主要表达于肾小管上皮细胞胞浆中，ACE2主要表达于肾组织近端肾小管上皮细胞的管腔膜。图像分析结果显示，与野生小鼠相比较，AGT和REN转基因鼠肾组织ACE和ACE2表达无明显变化(P＞0.05);AGT－REN双转基因高血压小鼠肾组织中ACE的表达显著升高，ACE2表达明显降低(P ＜0.05)，见图2～4。

4 Western blotting结果

Western blotting结果显示，与野生小鼠相比，AGT转基因鼠肾组织ACE和ACE2表达变化无明显差异;REN转基因鼠肾组织ACE表达变化差异不显著，ACE2表达降低(P＜0.05);AGT－REN双转基因鼠ACE表达明显升高，ACE2表达显著降低，见图5A。与野生小鼠相比，AGT－REN双转基因鼠肾组织ACE/ACE2比值明显升高，表达失衡(P＜0.01)，见图5B。

Figure 2.The results of immunohistochemical staining for ACE in kidneys(×200).A:WT mice;B:AGT mice;C:REN mice;D:AGT －REN mice.图2 ACE免疫组化染色结果

Figure 3.The results of immunohistochemical staining for ACE2 in kidneys(×100).A:WT mice;B:AGT mice;C:REN mice;D:AGT－REN mice.图3 ACE2免疫组化染色结果

Figure 4.The results of mean absorbance values(by immunohistochemistry)of ACE and ACE2.*P ＜ 0.05 vs WT mice.图4 ACE和ACE2免疫组化吸光度值分析结果

Figure 5.Western blotting analysis of ACE and ACE2 protein expression in kidney tissues of different mice.A:the expression of ACE and ACE2 in kidneys;B:the ratio of ACE to ACE2 calculated by ImageJ.*P ＜ 0.05 vs WT and AGT mice;△△P ＜0.01 vs other groups.图5 Western blotting检测ACE和ACE2蛋白表达结果

讨 论

基础和临床研究均表明，原发性高血压是一种多基因遗传性疾病，其中RAS的基因与高血压的发生关系最为密切，它们在正常血压的调控和高血压的发病中发挥非常重要的作用。ACE和ACE2是RAS中重要的组成成分，以往人们只是认为ACE在血压调节中发挥了重要作用，但随着ACE2的发现和深入研究，人们认识到ACE2不仅对血压调节发挥了重要的作用，而且对高血压造成的靶器官损害具有保护作用［6］。

本实验中AGT和REN单转基因小鼠并未见血压升高，而AGT－REN双转基因小鼠可见血压明显升高，其原因可能为人血管紧张素原或肾素不能与小鼠内源性的RAS系统发生酶促反应，即人的肾素不能水解小鼠的血管紧张素原，小鼠的肾素不能水解人的血管紧张素原，而肾素催化血管紧张素原的反应是整个 RAS系统中酶促反应的限速步骤［7］。AGT－REN双转基因小鼠体内同时含有人AGT和REN基因，使其血浆及组织中AngⅡ水平显著升高［8－9］，引起严重的高血压。有文献报道，AngⅡ水平升高可上调ACE的表达，并且下调ACE2的表达［10］，本实验免疫组化结果和Western blotting均显示AGT－REN双转基因小鼠肾组织中ACE表达升高，ACE2表达明显降低，ACE/ACE2表达显著失衡。ACE具有强烈的缩血管以及促进细胞增殖的作用，双转基因小鼠肾组织中其高表达，可能与肾组织内膜增生、管壁增厚、管腔狭窄等病理改变的形成密切相关;而具有抗增殖作用的ACE2肾组织内低表达，也从另一方面促进了ACE的增殖作用。简言之，AGT－REN双转基因小鼠肾组织内ACE/ACE2表达失衡可能是造成其出现典型高血压病理改变的主要原因。本实验中另外有趣的发现是REN转基因小鼠血压不但没有升高，反而下降，推测可能是人REN基因的随机插入影响了血压调控位点所致;单转基因和双转基因小鼠的脉压差均高于野生型小鼠，可能由于血管弹性降低所致，其机制有待进一步研究。

RAS中，ACE/ACE2两条通路参与了血压的调节。ACE－AngⅡ－AT1R通路收缩血管升高血压，造成组织损伤，其机制可能为:(1)强烈的缩血管作用;(2)增加水钠潴留;(3)增强心肌收缩力，引起心肌纤维化和心肌肥厚;(4)促进细胞增殖，造成组织损伤。ACE2－Ang(1－7)－Mas通路舒张血管降低血压，在对抗高血压疾病的发生发展过程中发挥着关键作用［11］。目前认为，ACE2调节血压的作用机制主要有以下几个方面:(1)分解AngⅡ减弱其升压作用，并且还可竞争ACE的底物AngⅠ，减少AngⅡ生成;(2)促进Ang(1－7)生成，舒张血管降低血压;(3)增加一氧化氮(NO)的释放［NO是强烈的舒血管物质，AngⅡ减少可降低NO消耗，Ang(1－7)增多可以促进NO的生成［12］］;(4)调节其它血管活性多肽系统。ACE2不仅在血压调节过程中发挥着重要作用，而且对高血压造成的靶器官损伤也起着保护作用。Huentelman等［13］研究发现，ACE2的主要产物Ang(1－7)能够拮抗AngⅡ的作用，抑制心肌重构，防止心肌纤维化，对心肌损伤起到保护作用。关于ACE2对高血压肾损伤起到保护作用的文献尚未见报道，但高血压肾损伤的产生可能是由于AngⅡ大量生成，ACE2水平降低造成的，提高ACE2的活性或者促进ACE2的生成，肾脏损伤情况应有所改善。

目前，ACE 抑制剂(ACE inhibitors，ACEI)类药物已广泛用于临床并取得良好效果。Ferrario等［14］研究发现，给予高血压大鼠ACEI类药物后，在血压下降的同时，心肌ACE2 mRNA水平升高，心肌损伤程度减轻。这提示降低ACE活性，提升ACE2表达水平，促进ACE/ACE2平衡调节，可能是ACEI类药物治疗高血压的作用机制之一。另一方面，体外给予高血压患者ACE2类药物或者促进ACE2体内合成，进而调节ACE/ACE2表达平衡，也能起到降低血压的效果。Wysocki等［15］也已研究证明，体外给予AngⅡ升高造成的高血压鼠人重组ACE2蛋白后，可显著降低血清AngⅡ水平，起到降低血压的效果。由此可见，ACE2作为抑制高血压和对靶器官损伤发挥保护作用的重要物质，将会为防治高血压和其它相关疾病带来新的希望。

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