人类肾上皮细胞氧化损伤模型的建立*

彭 花，邓穗平，谈 金，蒋建伟，欧阳健明△

(暨南大学1生物矿化与结石病防治研究所，2医学院，广东 广州 510632)

肾小管上皮细胞损伤是引起肾结石形成的重要原因之一。这些细胞受损后，由于基底膜直接暴露于管液中，有助于微晶的滞留和生长，成为结晶巢;此外，膜碎片在过饱和管液中还可促使异质成核，甚至阻塞肾小管，产生了一个有利于晶体生长的环境，从而促进肾结石形成［1］。目前对肾石病机制的研究多采用细胞模型、动物实验模型和生物膜模型。细胞模型采用的细胞系主要有来源于Hampshire猪和美国负鼠的近曲小管细胞(LLC－PK1和OK－1)、来源于正常雄性矮脚长耳猎犬肾脏的集合管道和远曲小管的细胞(MDCK－I和MDCK－II)［2］、来源于非洲绿猴和大鼠肾上皮细胞(BSC－1和NRK－52E)［3］以及犬和鼠肾髓质集合管细胞(RCCD1［2］和IMCD);动物模型多采用诱导鼠肾损伤，建立损伤模型的方法［4］;生物膜模型则采用生物细胞膜的简化模拟体系进行研究［5］。人类近端肾上皮细胞来源于人近端肾小管上皮细胞系(human kidney proximal tubule epithelial cell line，HKC)。研究表明，草酸、草酸钙晶体以及自由基对HKC有损伤作用［6］。然而对HKC进行损伤，建立确切的损伤细胞模型还未报道。因此，损伤细胞模型的建立有助于从病理上研究泌尿系结石的形成机制。

材料和方法

1 材料和仪器

1.1 材料 HKC来源于上海长征医院。培养液DMEMF12和新生牛血清(Gibco)，青霉素(华北制药股份有限公司)，链霉素(大连美罗大药厂)，细胞増生分析试剂盒(CCK－8)(日本同仁化学研究所)。其它常规试剂均为分析纯。

1.2 仪器 XL－30型环境扫描电子显微镜(ESEM，Philips);倒置荧光显微镜(IX51)(奥林巴斯公司);激光共聚焦荧光显微镜(510 META DUO SCAN，CARL Zeiss);酶标仪(Safire 2，Tecan)。

2 方法

2.1 细胞培养 HKC用含10%新生牛血清的DMEM－F12培养液培养，同时加入100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素。培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。HKC传代采用胰蛋白酶消化法。细胞达80%融合后用37℃的D－Hanks平衡液洗涤2次，加入0.25%胰酶消化液，37℃放置3～5 min后在倒置显微镜下观察消化程度，当细胞变圆，细胞之间出现孔隙且不再连接成片时，加入含10%新生牛血清的DMEMF12培养液，终止消化，并吹打细胞脱离瓶壁形成单细胞悬液。

2.2 细胞活力检测 将HKC悬液(浓度1×107cells/L)接种于96孔培养板中，每孔0.1 mL;孵育24 h后加入无血清的DMEM－F12孵育12 h，使细胞同步化。将孔板上的细胞分为2组，A组和B组。A组为空白组，只加入无血清培养液;B组为H2O2损伤组，加入含1 mmol/L H2O2的无血清培养液对细胞进行损伤，损伤时间分别为 0、0.5、1、1.5、2 和 3 h。达到预定的损伤时间后，将2组细胞都改用新鲜的无血清培养液培养，每孔加入10 μL CCK－8溶液，于37℃下孵育4 h后，用酶标仪在450 nm处测量吸光度A值，各个条件下的细胞平行测定3个重复孔，然后求A值的平均值，细胞活力=

2.3 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的检测 按细胞浓度为5×107cells/L、500 μL/well将单细胞悬浮液接种于24孔培养板中。按照上面方法孵育及损伤细胞后，将细胞悬浮液移入EP管内，在4℃离心10 min。取上清液，采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作，用比色法分别在波长为532 nm和550 nm处测定MDA和SOD的吸光度A值。

2.4 细胞表面骨桥蛋白(osteopontin，OPN)检测与定量 按细胞浓度为2×108cells/L、2 mL/well将单细胞悬浮液接种于6孔培养板中。细胞孵育及损伤达到预定时间后，吸除所有上清液，用PBS洗3次，每次5 min;加入4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS洗3次;加入羊血清封闭20 min，滴加兔抗人OPN抗体(sc－20788，Santa Cruz)(1∶150)，于37 ℃下孵育1 h，PBS洗3次。滴加FITC标记羊抗兔IgG抗体(sc－2012，Santa Cruz)(1∶100)，放于暗处，在 37℃下孵育 30 min，PBS充分冲洗3次。使用4'，6－二脒基－2－苯基吲哚(DAPI)封闭液(sc－24941，Santa Cruz)封片。对照组以兔血清代替OPN抗体。于激光共聚焦荧光显微镜下观察荧光。细胞核为蓝色，骨桥蛋白显绿色。实验重复进行3次。

确定FITC绿色荧光定量条件后，FITC荧光通道各条件不变(激发光波长:488 nm)，调节视野，拍摄一定数量的荧光图片(10张左右)，使每个样品的图片中细胞总量在100个左右，运用Axio Vision Release 4.7软件(Zeiss)分别计算各个细胞的荧光吸光度值，使用SPSS统计软件进行数据统计，计算荧光吸光度平均值。

2.5 细胞损伤前后形貌观察 按细胞浓度为1×108cells/L接种于铺有盖玻片的12孔板中，每孔1 mL，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。孵育24 h后，加入无血清的DMEM－F12孵育12 h。吸除培养液，用D－Hanks洗涤细胞2次。将孔板上的细胞分为2组:A组为空白组;B组为损伤组，加入含H2O2(1 mmol/L)的无血清培养液。孵育一定时间(0、0.5、1、1.5、2、3 h)后，用PBS洗3次，2.5%的戊二醛于4℃固定24 h。然后于50%、70%、90%、100%乙醇中脱水，再用乙酸异戊酯固定后CO2临界干燥样品，喷金处理，扫描电子显微镜观测细胞形貌及超微结构。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析实验结果，数据用均数±标准差()表示。Tukey检验分析各实验组与对照组均数间的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 H2O2对HKC活力的影响

通过检测H2O2对HKC的增殖抑制作用，确定H2O2对HKC的损伤程度。用1 mmol/L H2O2作用HKC 0.5 h后，细胞活力为(55.0±4.4)%，表明HKC已经发生明显的损伤(P＜0.05);作用1 h后，细胞活力显著下降到(43.6±3.1)%;随着H2O2作用时间的延长，对细胞的损伤进一步加剧，细胞活力进一步降低;作用2 h后，HKC活力为(40.0±3.6)%(P ＜0.05)，见图1。

2 HKC损伤后的MDA含量和SOD活性变化

H2O2作用HKC 0.5 h后，MDA含量从对照组的(0.38±0.03)μmol/L上升到(1.00±0.08)μmol/L(P＜0.05)。随着作用时间增加，MDA含量增加;当作用2 h时，MDA含量达到最大值(1.48±0.08)μmol/L。

1 mmol/L H2O2作用HKC 0.5 h后，SOD活性明显降低［(108.3±2.3)×103U/L vs(104.2±2.9)×103U/L，P＜0.05］。随着H2O2作用细胞的时间分别增加到1和2 h后，SOD活性分别降至(102.7±2.2)×103U/L和(87.0±2.3)×103U/L(P ＜0.05)，见图2。

3 HKC损伤后OPN的表达

正常HKC(0 h)周围没有或只有少量的OPN表达，1 mmol/L H2O2损伤0.5 h、1 h和2 h后，HKC周围出现大量OPN表达(P＜0.05)，见图3。

Figure 1.Cell viability of HKC after exposure to 1 mmol/L H2O2 for different time..n=3.*P＜0.05 vs 0 h.图1 1 mmol/L H2O2作用HKC不同时间后细胞活力的变化

Figure 2.Changes of MDA content and SOD activity in HKC after exposure to 1 mmol/L H2O2for different time..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.图2 1mmol/L H2O2作用HKC不同时间后MDA含量和SOD活性的变化

Figure 3.Expression of OPN on the surface of HKC after exposurt to 1 mmol/L H2O2for different time..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.图3 损伤前后HKC表面OPN的表达

4 细胞损伤前后形貌的变化

图4为正常HKC和1 mmol/L H2O2损伤0.5、1、2 h后细胞形貌的SEM图片。正常细胞形态饱满、表面完整光滑，见图4A;损伤1 h后，细胞干瘪收缩，表面粗糙，其鞭毛、突触大都断裂脱落，见图4C。

讨 论

在生物体内，肾上皮细胞在病理情况下通过非酶反应与酶促反应产生大量氧自由基。而生物膜的主要成分磷脂含有不饱和脂肪酸，氧自由基对这些不饱和脂肪酸中的不饱和键具有很高的亲和力，从而产生过氧化反应，导致细胞损伤。MDA是细胞脂质过氧化反应的终产物，其含量的多少可反映机体内脂质过氧化的程度，也间接地反映出细胞受损伤的程度。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但在一般的条件下人体细胞内也存在着清除自由基的物质，如抗氧化酶类，其中SOD是一种主要的抗氧化酶，可对抗氧自由基对细胞造成的损害。生物体内SOD水平的降低意味着生物体抵抗自由基损伤的能力降低，反映机体受自由基损伤的程度。

Figure 4.SEM images of morphology of normal and injured HKC.A:normal cells;B:injury 0.5 h;C:injury 1 h;D:injury 2 h.Scale bar:5 μm.图4 损伤前后HKC表面形貌的SEM照片

H2O2虽不是自由基，但它属于活性氧类，有高反应性，可促进自由基的生成，引发生物膜的脂质过氧化反应，导致细胞膜的超微结构发生变化，甚至渗入细胞内部，破坏线粒体和DNA结构，引起细胞坏死和凋亡［7］。我们的实验结果表明，H2O2对HKC的氧化性损伤非常明显，表现为细胞的增殖受到影响，细胞活力下降，脂质过氧化产物MDA的释放量增加，抗氧化酶SOD的水平下降。

从化学的观点看，肾结石的形成与尿液中结石盐的高度过饱和、抑制剂或促进剂的浓度和活性以及尿路细胞膜的脂质过氧化损伤等有关［8］。HKC受损伤后，细胞膜表面不但能为初始晶核的形成提供有效位点，而且增强了细胞膜与矿物质的黏附，从而增加了肾结石形成的危险性［6］。以往研究表明，动物的肾小管上皮细胞损伤后，一水草酸钙(calcium oxalate monohydrate，COM)晶体的黏附最大可增加 20 倍［9］;鸟粪石的附着力可增加5～6倍［10］。

正常细胞表面具有抗晶体黏附作用，当细胞损伤之后，细胞的表面微结构发生改变，并表达大量能够吸引钙离子和草酸钙晶体的带负电荷的物质，如透明质酸(hyaluronic acid，HA)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)、胶原蛋白、OPN等。其中OPN的相对分子质量约为44 kD，约含300个氨基酸残基，其中带负电荷的天冬氨酸与谷氨酸和不带电的丝氨酸占总氨基酸量的一半。研究表明，溶液中游离的OPN能抑制草酸钙晶体的成核、生长、聚集和对细胞的黏附;而细胞表面聚集的OPN则能促进晶体的黏附［11］。我们的实验结果显示，1 mmol/L H2O2损伤 HKC后，细胞表面表达了大量的OPN，并在1 h时达到最大(图3)。位于细胞膜上OPN的量越多，促进晶体黏附的可能性就越大;而且，损伤后产生的细胞碎片也可以促进晶核的形成。因此，HKC损伤后，可加速并促进晶体的生长和黏附，最终导致肾结石形成。

本文研究了H2O2对培养的HKC的致损伤作用。HKC损伤后，细胞活力和SOD浓度下降，MDA含量上升，细胞膜表面的微绒毛断裂与脱落，且在膜上表达能够黏附尿石矿物的蛋白分子OPN。因此，用1 mmol/L H2O2作用HKC 1 h所建立的氧化损伤模型，有助于从细胞水平和分子水平上阐明肾结石形成的病理和形成机制。

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