过敏性紫癜患儿血管内皮细胞凋亡与血清IgA水平关系探讨①

袁丽萍 张 琴 鹿 玲 (安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥230022)

过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)是儿童时期、一种较常见的毛细血管变态反应性出血性疾病，可伴有消化道症状、关节肿痛及肾脏损害。其病因及发病机制尚不完全清楚，目前认为HSP是一种由IgA介导的循环免疫复合物介导的系统性血管炎，即体内IgA-IC免疫复合物形成并沉积于局部血管，激活补体，引起中性粒细胞及一系列细胞因子活化，导致血管受损［1］。由于血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VEC)是血液和血管平滑肌的屏障，是血管中首先受损的部分。最新研究发现HSP患儿PBMC培养上清可以诱导培养的血管内皮细胞凋亡［2］，但是HSP患儿本身VEC凋亡及体内IgA水平与其VEC凋亡的关系迄今却未见报道。因此，本研究通过ELISA法检测HSP患儿血清中IgA水平，TUNEL法检测其皮肤组织中VEC凋亡的情况，并分离HSP患儿血清中IgA，观察IgA对培养的HUVEC细胞凋亡的影响，初步探讨IgA与HSP患儿VEC凋亡的关系，为进一步明确HSP发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2004年1月～2005年12月安徽医科大学第一附属医院儿科住院的HSP患儿40例，男性22 例，女性18 例，年龄3.5 ～13.5 岁，平均8.5岁，均符合2005年欧洲风湿病学会修订的HSP诊断标准［3］。HSP患儿中有消化道出血症状10例，有不同程度血尿、蛋白尿及其他肾脏受累症状14例，排除上述症状的其他病例16例。正常对照组为无过敏性疾病史的健康体检儿童10例，其中男5例，女5例，年龄3～12岁。各组年龄、性别分布情况见表1，各组年龄、性别无显著性差异(P＞0.05)。所有研究对象均于清晨空腹抽取周围静脉血5 ml留取用于IgA分离。采集标本前1月内均未接受激素及免疫抑制剂或调节剂治疗。受试者家属对实验均已知情，并经医院学术伦理委员会讨论通过。

1.2 实验方法

1.2.1 外周血采集 各病例组在HSP急性期，清晨空腹采取周围静脉血2 ml非抗凝全血，室温下放置2小时后，离心机离心15分钟，转速为4 000 r/min，取血清放于-80℃低温冰箱中保存，一部分用于ELISA检测血清中IgA水平，其余用于IgA的分离。健康对照组血液标本采集方法同上。

1.2.2 皮肤标本采集 各病例组患儿用2%利多卡因进行局部麻醉下，在下肢伸侧皮损区(新鲜皮疹)边缘皮肤用角膜环钻取直径为6～8 mm大小的皮肤组织。健康对照组10例标本取自整形科患儿正常皮肤组织。

1.2.3 TUNEL凋亡细胞显示方法 (采用AP原位细胞凋亡检测试剂盒)石蜡切片脱蜡入水后，以新鲜配制的3%H2O2室温10分钟灭活内源性过氧化物酶。以Proteinase K，37℃消化5分钟。滴加DIG-dUTP和标记缓冲液，4℃标记过夜。封闭液室温30分钟，滴加碱性磷酸酶-抗地高辛抗体，37℃ 30分钟。滴加新鲜配制的BCIP/NBT显色液，镜下控制显色时间，水洗终止显色，油镜下观察结果。凋亡细胞为胞核着色，染色呈棕黄色。凋亡指数(AI)为每100个血管内皮细胞中染色阳性的凋亡细胞。

1.2.4 IgA的分离与鉴定 取HSP患儿血清，采用Jacalin亲和层析分离血清中 IgA［4］，过程如下:血清用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(Phosphate bufer saline，PBS)按1∶1稀释后上Jacalin亲和层析柱(Pierce Chemical Company，USA)，于室温孵育30分钟，用175 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)以1 ml/min的速度洗去未与Jacalin结合的成分，用含0.1 mol/L蜜二糖的175 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)以1 ml/min的速度洗脱与Jacalin结合的成分，洗脱液蛋白经琼脂糖交叉免疫双扩散实验和免疫电泳实验证实为IgA，将洗脱液用分子量20 000的聚乙二醇(PEG 20 000)浓缩，放入200倍体积的蒸馏水中透析以去除蜜二糖。用Bradford法测定所得样品中IgA的浓度。

1.2.5 HUVEC细胞培养及分组 HUVEC细胞购自南京凯基生物有限公司，用含10%胎牛血清(Hyclone公司)的RPMI1640培养基培养，放入37℃，5%CO2的细胞培养箱培养，每2～3天换液一次，待细胞长至融合状态时，可传代，取传自Ⅲ～Ⅳ代细胞进行实验。

将分化成熟的HUVEC按每孔106个细胞接种于6孔培养板，每孔体积2 ml。将 6孔板放入37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，当细胞长至部分融合后，每孔用PBS洗涤2次。随机将细胞分为4组:①空白对照组:HUVEC于无血清培养液;②正常对照组:HUVEC于含有正常血清中分离的IgA 250 mg/L的培养液培养24小时;③HSP组:HUVEC于含有HSP血清中分离的IgA 250 mg/L的培养液培养24小时，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学分析 数据均采用SPSS13.0进行统计学处理，所有计量资料均用±s表示;多组资料间比较，采用单因素方差分析(One-way ANOVA);对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析。P＜0.01为有显著性意义。

2 结果

2.1 HSP患儿急性期血清IgA水平变化 各组血清中IgA浓度见表1，HSP患儿普通型、合并肾脏受累(肾型)、合并消化道出血(腹型)急性期血清IgA浓度与健康对照组相比较均明显升高(P＜0.01);而HSP各型比较无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 TUNEL法检测HSP患儿皮肤组织中VEC细胞凋亡 TUNEL染色方法结果显示显微镜下可见皮肤中凋亡VEC细胞核呈棕黄色，健康对照组可见少量的细胞核为棕黄色的VEC，HSP组可见较多分布凋亡细胞，尤其在肾型和腹型HSP组(图1)。对各组VEC凋亡细胞计数结果表明HSP各组凋亡指数与健康对照组比较有显著差异(P＜0.01)，而HSP各型凋亡指数无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组年龄、性别分布状况Tab.1 Ages and sex in groups

表2 HSP患儿急性期血清IgA水平(±s)Tab.2 IgA levels in serum of HSP patients during active stage±s)

表2 HSP患儿急性期血清IgA水平(±s)Tab.2 IgA levels in serum of HSP patients during active stage±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with healthy control group.

Groups n IgA(g/L)HSP(general type) 16 2.87 ±0.581)HSP(renal type) 14 3.26 ±0.951)HSP(abdominal type) 10 3.63 ±0.861)Normal control 10 1.82 ±0.57

图1 TUNEL法检测HSP患儿皮肤组织血管内皮细胞凋亡(×200)Fig.1 Apoptosis of HUVEC in skin of HSP patients by TUNEL methods(×200)

图2 HSP患儿皮肤组织血管内皮细胞凋亡水平Fig.2 Apoptosis index of HUVEC in skin of HSP patients

图3 HSP患儿血清IgA水平与皮肤组织血管内皮细胞凋亡关系Fig.3 Correlation between the serum IgA levels and apoptosis of HUVEC in skin of HSP patients

2.3 HSP患儿急性期血清IgA水平与其血管内皮细胞凋亡关系 经Pearson相关分析结果显示，HSP患儿血管内皮细胞凋亡指数与其血清中IgA水平呈正相关((r=0.23，P ＜0.01，图 3)，提示 HSP 患儿VEC凋亡可能与IgA水平有关系。

图4 流式法测定HSP患儿血清中IgA对HUVEC凋亡的影响Fig.4 Apoptosis rate of HUVEC induced by IgA with FCM

表3 流式法测定IgA诱导的HUVEC凋亡率(±s)Tab.3 Apoptosis rate of HUVEC induced by IgA with FCM(±s)

表3 流式法测定IgA诱导的HUVEC凋亡率(±s)Tab.3 Apoptosis rate of HUVEC induced by IgA with FCM(±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with HSP group.

Groups n Apoptosis rate(%)1640 10 6.12 ±0.241)HSP 10 17.53 ±0.82

2.4 HSP患儿急性期血清中分离的IgA水平诱导HUVEC凋亡的作用 用流式细胞仪检测HSP患儿血清中IgA对分离培养的HUVEC凋亡的影响，结果显示与1640空白对照组比较，IgA显著诱导分离培养的HUVEC 凋亡(17.53 ±0.82 vs 6.12 ±0.24)，见图 4、表 3。

3 讨论

血管内皮细胞的凋亡发生在许多过程中:胚胎发生、肿瘤发生、自身免疫等。血管内皮细胞凋亡导致的血管功能异常，将引起多种炎症性疾病的发生。文献检索结果显示［5］，血管内皮细胞的凋亡在多种系统性血管炎疾病发生中的作用目前受到学者们越来越多的关注。研究发现在川崎病、变应性肉芽肿病及韦格纳肉芽肿等血管炎疾病中观察到内皮细胞凋亡上调，加重血管壁的炎症反应［6］。这些结果提示血管内皮细胞凋亡在血管炎发病机制中可能起着比我们所想象的更重要的作用，这可能为血管炎治疗提供新的干预措施。

本研究中我们采用皮肤环钻行皮肤组织活检，TUNEL法检测发现在HSP患儿皮肤中可以看到明显的VEC凋亡，且其血清中IgA水平明显升高，进一步分析发现HSP患儿VEC凋亡与血清中IgA水平有着显著相关性，提示HSP患儿VEC凋亡可能与IgA高表达有关。为深入探讨HSP患儿血清中IgA与VEC凋亡的关系，我们分离了HSP患儿血清中IgA，观察其对分离培养的HUVEC凋亡的影响，结果显示IgA诱导下，HUVEC发生显著凋亡。

研究证实血管内皮细胞的损伤是HSP发生的病理基础［7］。血管内皮细胞在各种致炎因素(如内毒素、病毒、抗原/抗体复合物、血流动力学的改变、血小板、激素和一氧化碳等)的攻击下，血管内皮细胞常常发生损伤或凋亡。凋亡的VEC导致内皮细胞屏障功能，最后导致微血管通透性升高。我们研究初步证实HSP患儿血清中IgA与其血管内皮细胞凋亡有关，这也许是HSP患儿血管内皮细胞损伤的一可能机制，但是IgA诱导血管内皮细胞凋亡的机制及与HSP患儿血管内皮细胞损伤的关系有待深入研究。

1 高兴华，陈 楠.血管炎的发病机制［J］.皮肤病与性病，2008;30(1):12-13.

2 刘 磊，江悍平，王 兵.IL-10在过敏性紫癜血管内皮细胞损伤中的作用机制研究［J］.小儿急救医学，2004;41(1):225-227.

3 Ozen S，Ruperto N，Dillon M J et al.EULAR/PReSendorsed consensus criteria*for the classification of childhood vasculitides［J］.Ann Rheum Dis，2006;65:936-941.

4 于立坚，马晓明，姚养正 et al.从正常人血清中同时分离、纯化IgA 和 IgG［J］.陕西医学杂志，1979;1(1):25-27.

5 Savage CO.The evolving pathogenesis of systemic vasculitis［J］.Clin Med，2002;2(5):458-464.

6 游 浩，陈方舟，朱胜文 et al.VEC增殖与凋亡调控及其对血管瘤细胞凋亡的影响［J］.江汉大学学报(自然科学版)，2008;36(1):57-59.

7 Yang Y H，Wang SJ，Chuang Y H et al.The level of IgA antibodies to human umbilical vein endothelial cells can be enhanced by TNF-α treatment in children with Henoch-Schonlein purpura［J］.Clin Exp Immunol，2002;130(2):352-352.