流感病毒诱导小鼠胶质细胞的细胞因子级联反应①

周健祥 王革非 蒋治武 曾 俊 苏 芸 李康生

(汕头大学医学院微生物学与免疫学教研室广东高校免疫病理重点实验室，汕头515041)

流感急性脑病(Influenza acute encephalopathy，IAE)是流感病毒感染的重要并发症之一，患者在病毒感染后在呼吸道症状出现1～2天内发生严重的神经症状，表现为快速发展的认知障碍、精神状态改变、意识消退、昏迷等，严重时引起神经后遗症或死亡，其中A型流感病毒H3亚型比H1亚型和B型流感病毒，有更高的发病率［1-3］。流感急性脑病患者中80%左右为5岁以下儿童，死亡率约30%，此外约有25%的患儿会出现神经后遗症。目前，IAE的发病机制依然不明。在流感相关脑病病人的脑脊液(CSF)和血浆中，发现TNF-α、IL-1等促炎症细胞因子的浓度升高［4，5］。认为脑病可能是因机体在感染流感病毒后释放促炎症因子，进而诱导了细胞因子级联反应，造成CNS发生以促炎症因子和趋化因子过度释放为特征的细胞因子风暴，引发神经及免疫系统功能紊乱和CNS的免疫病理损伤［6-8］。

星形胶质细胞是脑内细胞因子的重要来源，其数量占脑内细胞总数的50%以上，对神经元起支持和营养作用［9］，直接影响神经元的存活，通过调节谷氨酸的摄取和释放，以及清除自由基、水分运输，产生细胞因子、趋化因子和一氧化氮来调节神经系统微环境，对维持脑内稳态，血脑屏障稳定举足轻重［10-13］。而作为神经系统中的免疫细胞，小胶质细胞在众多神经退行性病变中发挥重要功能，如帕金森症、多发性硬化症和阿茨海默症等。小胶质细胞是促炎性因子的主要来源，早期研究证实，过度激活小胶质细胞会引起神经毒性作用［14］。而近期研究发现，小胶质细胞的激活亦可以发挥神经保护作用，如吞噬死亡的神经元、清除代谢废物［15］。

我们前期研究发现流感病毒可以感染星形胶质细胞和小胶质细胞，并造成大量促炎细胞因子和趋化因子释放［16］。而由流感病毒感染胶质细胞所释放的大量细胞因子对正常胶质细胞生物学功能有何影响尚未见报道。因此，本研究利用人流感病毒H1N1和H3N2感染小鼠星形胶质细胞获得条件上清，利用条件上清刺激正常星形胶质细胞和小胶质细胞，检测相关促炎细胞因子和趋化因子的转录水平，为研究IAE所伴随的细胞因子级联放大及细胞因子风暴提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 1至2日龄无特异病原(Specific Pathogen Free，SPF)的BALB/c小鼠由汕头大学医学院实验动物中心提供。

1.2 流感病毒毒株 人A型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)和A/Shantou/602/2006(H3N2)。流感病毒在MDCK细胞进行初步增殖收获病毒母液，病毒为本室保存。经空斑法测定病毒滴度，-80℃保存。

1.3 新生小鼠大脑皮层神经胶质细胞的培养 将1至2天新生小鼠大脑皮层组织取出，使用巴斯德吸管于DMEM/F12(1∶1，v/v)培养基中吹打至组织团块分散成单个细胞，用200目滤网过滤得到细胞悬液。37℃放置30分钟，去除贴壁的成纤维细胞。未贴壁细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养。接种后第2天和第4天，弃去未贴壁的细胞，更换培养基。以后每7天更换一次培养基，至混合胶质细胞长成单层(约21天)。

1.4 小鼠大脑皮层星形胶质细胞与小胶质细胞的分离 长成单层的混合胶质细胞用DMEM/F12稀释的胰酶(2∶1，v/v)37℃作用约7分钟，将含有星形胶质细胞的胰酶液经血清终止、离心后重悬培养。贴壁24小时后将细胞培养瓶固定于定轨摇床(上海智诚)中37℃、200 r/min、水平震荡2小时，弃悬浮细胞，加入含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，杭州四季青)的DMEM/F12培养基(美国Gibco)继续培养1天后，按上述方法再次进行震荡分离，得到纯化后的星形胶质细胞。

长成单层的混合胶质细胞用0.08%胰酶37℃作用约15分钟，镜下观察星形胶质细胞脱落后，弃去消化液，使用预热DMEM/F12漂洗2遍加入胰酶消化液(0.25%trypsin/0.02%EDTA，Invitrogen)37℃作用5～10分钟，得到小胶质细胞组分，经终止、离心后用10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。

1.5 星形胶质细胞与小胶质细胞的纯度鉴定 胶质细胞纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形胶质细胞的表面特异性标志，CD11b是小胶质细胞的表面特异性标志，利用间接免疫荧光法对分离后的小胶质细胞与星形胶质细胞进行纯度鉴定。

1.6 流感病毒感染星形胶质细胞 按照每孔1×105个细胞，将星形胶质细胞接种于十二孔板，细胞贴壁24小时后，用500μl含有2×105pfu流感病毒(H1N1和H3N2)的病毒液感染，感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为 2，37℃吸附 1 小时。吸附结束后，每孔加入 500μl无血清 DMEM/F12，37℃、5%CO2培养箱中培养。设立未感染孔为阴性对照。感染后6小时和24小时收集上清液，经超滤分子截留(PALL，300 kD)去除流感病毒颗粒后，获得条件上清，用于刺激正常星形细胞和小胶质细胞。阴性对照孔上清采用相同方法处理。

1.7 条件上清刺激正常胶质细胞 按照每孔1×105个细胞，分别将星形胶质细胞和小胶质细胞接种于十二孔板，细胞贴壁24小时后，使用预热DMEM/F12培养基漂洗3遍，每孔加入500μl条件上清，对照孔加入阴性对照上清，培养24小时。

1.8 胶质细胞RNA的提取及反转录 刺激后的胶质细胞，使用 Trizol(Invitrogen)提取细胞的RNA，经紫外分光光度计检测RNA含量。取1μg的RNA，用M-MLV first stand kit试剂盒(Invitrogen)反转录，采用试剂盒自带随机引物，反应体系为20μl。操作步骤按照Invitrogen公司说明书，反转录后的cDNA用于Real-Time-PCR反应。

1.9 条件上清刺激正常胶质细胞后炎症相关因子的 Real-Time PCR 检 测 使 用 Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)试剂盒，对TNF-α、IL-6、IL-1β、IP-10(Interferon-gamma-Inducible Protein)、MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein)、MIP-1(Macrophage Inflammatory Protein)、GDNF(Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor)进行转录水平检测，以 β-actin作为内参，引物为 QIAGEN公司产品。反应体系为20μl，操作步骤按照Invitrogen公司说明书，使用ABI7300荧光定量PCR仪进行检测。

2 结果

2.1 小鼠胶质细胞的分离与培养 图1所示，通过温和胰酶分离和物理分离相结合的方法可得到纯化的星形胶质细胞，利用不同浓度胰酶的分步消化可得到纯化的小胶质细胞，星形胶质细胞用GFAP为细胞特异性标志进行检测，小胶质细胞选用细胞特异性表面标志CD11b进行免疫荧光检测。细胞均出现特异性的荧光染色，相应的对照细胞或一抗缺失样品则没有荧光出现，星形胶质细胞和小胶质细胞的纯度均超过95%。

2.2 不同时间点条件上清刺激正常胶质细胞诱导细胞因子转录水平上调 使用Real-Time PCR检测不同时间点条件刺激小胶质细胞及星形胶质细胞后，促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6，趋化因子 IP-10、MCP-1、MIP-1及胶质细胞来源营养因子GDNF的表达变化情况。以 β-actin作为内参，反应体系为20 μl，每种细胞因子设立3 个复孔，使用 2-△△Ct法，计算目的基因表达量的变化。进行三次独立重复实验，获得目的基因表达量变化平均值，基因表达结果见图2、3。由图2的结果表明:以星形胶质细胞作为刺激对象，不同时间点的条件上清均能诱导星形胶质细胞炎性因子、趋化因子及胶质细胞来源营养因子转录水平上调，其中IL-1β的转录水平变化程度最高，6小时条件上清刺激后其上调水平，分别为对照组的555.97倍和1 303.71倍。6小时条件上清比24小时条件上清，可以诱发更强的TNF-α、IL-6、IL-1β三种促炎因子的表达(P＜0.05)。所检测的三种趋化因子中，IP-10上调程度高于MCP-1、MIP-1。胶质细胞来源营养因子GDNF的表达也发生了上调，但是不同时间点、不同病毒株来源的条件上清刺激星形胶质细胞后，其表达量之间无显著差异。

图1 混合胶质、星形胶质细胞和小胶质细胞的分离与培养(×200)Fig.1 Isolation and culture of mixed glia cells，microglia，and astrocytes(×200)

图2 条件上清刺激星形胶质细胞后细胞因子的转录水平变化Fig.2 The transcript levels of cytokines of conditioned supernatant stimulated astrocytes

图3 条件上清刺激小胶质细胞后细胞因子的转录水平变化Fig.3 The transcript levels of cytokines of conditioned supernatant stimulated microglia cells

图3结果表明:以小胶质细胞作为刺激对象，不同时间点的条件上清均能诱导小胶质细胞炎性因子、趋化因子，胶质细胞来源营养因子转录水平上调，其中IL-1β的转录水平变化程度最高，值得注意的是，不同毒株的条件上清引起小胶质细胞表达TNF-α的变化趋势，与其他因子的表达趋势相反，H1N1来源6小时条件上清刺激小胶质细胞后，TNF-α表达量高于24小时来源上清(P＜0.05)，而同种条件上清造成其他细胞因子的表达变化与其相反;H3N2来源6小时条件上清刺激小胶质细胞后，TNF-α表达量低于24小时来源条件上清(P＜0.05)，而同种条件上清造成其他细胞因子的表达变化与其相反，其中可能与流感病毒攻击星形胶质细胞后，所释放的细胞因子特点存在关联。

3 讨论

目前，流感相关脑病的发病机制依然不明。细胞因子风暴可能是致病机制之一，病毒感染患者后，激活固有免疫系统，造成促炎细胞因子的大量表达，伴随着过度分解蛋白和脂肪，产生有毒物质，随着血液循环，诱发肝、肾损伤，继而出现全身多器官衰竭;而血管内皮细胞的损伤和实质细胞的凋亡会直接导致脑水肿和急性脑炎［1］。大量文献报道，细胞因子风暴的主要特点是产生和分泌大量的、多种类的、超过正常生理水平的促炎症细胞因子，而高致病性禽流感H5N1的重要特征即可引起细胞因子风暴，其中TNF-α、IL-6、IFN-γ是引起细胞因子风暴的主要因子［17-19］。本实验室之前已经证明流感病毒H1N1和H5N1可感染星形胶质细胞和小胶质细胞，细胞分泌大量促炎因子和趋化因子，并造成细胞凋亡［16］。

因此，在前期试验的基础上，研究流感病毒感染星形胶质细胞后，所释放的细胞因子对正常神经胶质细胞造成的生理病理影响，为以后进一步研究流感相关脑病的病理机制提供依据。本研究利用人流感病毒感染小鼠星形胶质细胞后，获得去除病毒颗粒的条件上清，刺激正常的星形胶质细胞和小胶质细胞，利用Real-Time PCR检测促炎因子、趋化因子的转录表达水平。以星形胶质细胞作为刺激对象，不同时间点的条件上清均能诱导星形胶质细胞炎性因子、趋化因子、胶质细胞来源营养因子转录水平上调，其中IL-1β的转录水平变化程度最高，6小时条件上清比24小时条件上清，可以诱发更强的TNF-α、IL-6、IL-1β 三种促炎因子的表达(P ＜0.05)。以小胶质细胞作为刺激对象，不同时间点的条件上清均能诱导小胶质细胞炎性因子、趋化因子、胶质细胞来源营养因子转录水平上调，其中IL-1β的转录水平变化程度最高，IL-6的转录水平变化情况与IL-1β变化情况类似。有趣的是，不同毒株的条件上清引起小胶质细胞表达TNF-α的变化趋势，与其他因子的表达趋势相反，其中可能与流感病毒攻击星形胶质细胞后，所释放的细胞因子特点存在关联，可能为后期探寻发挥关键功能的因素提供线索。

流感病毒感染神经胶质细胞，导致促炎因子、趋化因子表达上调外［16］，本研究发现星形胶质细胞释放的大量细胞因子可对正常神经胶质细胞产生级联效应。不同时间点的条件上清刺激神经胶质细胞，相关促炎因子、趋化因子的变化水平不同，其可能原因是，不同时间点条件上清中所含细胞因子的种类，浓度不同。即流感病毒感染星形胶质细胞后，细胞因子的分泌情况具有阶段性特征［16］。临床上治疗流感相关脑病的手段主要是低温、抗炎治疗［20，21］。Kawashima等［22］报道，3例 IAE患者采用甲基强的松龙冲击疗法和血浆置换，去除细胞因子后，恢复良好无严重后遗症。Nancy Yuk-Yu Ip的研究小组，使用高致病性禽流感H5N1攻击人星型胶质和神经元细胞系，可直接造成细胞损伤，并且使用高剂量IL-6和TNF-α重组蛋白分别刺激细胞后，相关促炎细胞因子、趋化因子转录水平发生上调，与IL-6相比较，TNF-α可更加显著诱导 caspase3表达［23］。2009年暴发的新型H1N1大流感，患急性呼吸窘迫症的患者常并发细胞因子风暴，IL-6、TNF-α、IL-10起主要作用，患者血清中的IL-6、IL-10，脑脊液中IL-6的表达水平与神经系统并发症严重程度密切相关［5］。以本实验为基础，探索条件上清中引起级联效应的关键因子，找到有效抑制或降低级联效应的方法，维持脑内微环境的稳定，可为治疗流感相关脑病提供策略。

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