重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体的制备及鉴定①

张淑芹 梁重阳 刘志屹 戴 璐 张福明 孙 非 (吉林大学再生医学科学研究所，长春130021)

真菌灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)是1989年Kino等人从赤灵芝子实体中分离提取出的第一种真菌免疫调节蛋白，是由110个氨基酸组成，分子量12.4 kD，具有很强的免疫调节作用。本课题组将LZ-8的重组基因转移到酵母表达系统中获得了重组表达，制备出重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)［1，2］，并进行相关的药效学研究。由于rLZ-8的单克隆抗体的制备至今未见报道，本文拟应用杂交瘤技术制备鼠抗rLZ-8的单克隆抗体，为rLZ-8药效学的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要药品和试剂 重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)，本室提供;DMDM 细胞培养液、HAT(次黄嘌呤、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷)，Gibco公司，美国;羊抗兔辣根过氧化物IgG(IgG-HRP)、弗氏完全佐剂(CFA)、弗式不完全佐剂、PEG4000、OPD(邻苯二胺)、抗体亚类鉴定试剂盒，Sigma公司，美国;牛血清白蛋白(BSA)，Roche公司，美国。

1.2 主要仪器 酶标仪，TECAN;低温冰箱，NBS，美国;紫外可见分光光度计，尤尼克斯;岛津高效液相色谱仪，日本;AKTA蛋白质纯化仪，GE，美国;凝胶成像仪，天能科学仪器有限公司;电泳仪、半干转膜仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 细胞株及动物 SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，吉林大学再生医学科学研究所提供;免疫用BALB/c小鼠，中国军事医学科学研究院提供。

1.4 BALB/c小鼠的免疫 小鼠免疫按常规方法进行［3］，初次免疫用 rLZ-8(100μg)的 PBS稀释液与等体积的免疫用完全弗氏佐剂的混合物后腹腔注射免疫BALB/c雌性小鼠;第2～4次免疫以不完全弗氏佐剂乳化的rLZ-8(50μg)为免疫原，第5次用rLZ-8(50μg)作为免疫原。从第3次免疫开始，每次免疫后7天采血，ELISA法和Western blot法测定血清抗体的效价和特异性。

1.5 杂交瘤细胞的融合 细胞融合按常规方法进行［4］，在追加免疫后的第3天，选择一只效价最高的小鼠取脾细胞与SP2/0细胞进行融合，用50%的PEG4000作为融合剂，然后将融合细胞置于HAT培养液中进行选择培养。每天观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清检测抗体。

1.6 杂交瘤细胞的筛选 待杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时，用rLZ-8(1μg/ml)包被 ELISA板，用ELISA方法筛选阳性克隆孔。同时设SP2/0骨髓瘤细胞上清液作为阴性对照。OD值大于或等于阴性孔的2.1倍即为阳性孔，当阳性孔数量较多时，可选取其中部分OD值相对较高的孔做克隆化。

1.8.4 单克隆抗体效价的测定 将杂交瘤细胞制备的小鼠腹水以及细胞上清液用PBS缓冲液以1∶1 000开始稀释，以同等稀释度的注射SP2/0细胞的小鼠腹水以及细胞上清液作为阴性对照，采用间接ELISA方法进行大范围的初步筛选。然后根据单抗的效价范围进行细致稀释后继续采用间接ELISA方法在波长492 nm处测定OD值。阳性样品OD值大于或等于2.1倍阴性样品OD值的最高稀释倍数为该单抗的效价。

2.2 rLZ-8纯品的液相色谱图 rLZ-8纯品的液相色谱如图2所示，该蛋白在流速1 ml/min时的保留时间是7.622分钟，与图1对比。其分子量为12.4 kD，纯度在95%以上，符合制备单克隆抗体标准。

1.8 腹水制备、纯化及效价测定

1.8.1 腹水的制备 按常规方法将杂交瘤细胞数调至1×106～2 ×106个/ml的细胞悬液，向弗氏不完全佐剂致敏的小鼠腹腔注射0.5 ml/只。同时用SP2/0细胞制备阴性腹水，7～14天后收获腹水。用无菌离心管离心取上清分装后，于-80℃冰箱保存。

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1.8.3 单克隆抗体亚类的鉴定 采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒对本次制备的单克隆抗体亚类进行鉴定，方法为间接ELISA方法，包被抗原为纯化的rLZ-8，浓度为1 mg/ml，实验步骤按说明书进行。

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1.8.5 单克隆抗体特异性检测 用Western blot胶片曝光方法对rLZ-8单克隆抗体特异性进行分析。首先将rLZ-8进行SDS-PAGE电泳，然后将其电转印至PVDF膜上，再将膜转移至封闭液中，清洗后将制备的单克隆抗体作为一抗、羊抗鼠IgG-HRP作为二抗进行反应，最后经显影定影后观察结果。

2.1 蛋白分子量标准品的液相色谱 图1是蛋白标准品在流速1 ml/min时液相色谱图，每一个出峰时间对应一种分子量的蛋白，用来测定蛋白质的分子量。

2 结果

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1.8.2 腹水的纯化 采用AKTA纯化系统，Protein A Sepharose亲和层析柱对腹水进行纯化。将层析柱垂直固定在AKTA纯化系统上，将适量的Protein A Sepharose装入柱中，并将管路接好，以50 cm/h的速率装柱，待柱体完全沉降压实后，继续用5～10倍体积的20 mmol/L pH7.0磷酸钠盐缓冲液以2 ml/min的速度洗涤柱床至基线平衡为止;将收集的腹水上清液对20 mmol/L pH7.0磷酸钠盐缓冲液透析，以获得适当的pH和离子强度，然后将样品通过上样环加入亲和柱后，将流速调至0.4 ml/min，继续用20 mmol/L pH7.0磷酸钠盐缓冲液平衡;然后用20 mmol/L pH4.0柠檬酸钠盐缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体;并设定峰收集样品，-80℃冰箱保存备用。

1.7 杂交瘤细胞的克隆化 用有限稀释法制备杂交瘤细胞悬液，分别加入已铺好饲养层细胞的96孔培养板中培养，适时用倒置显微镜观察杂交瘤细胞生长情况，选择只有一个集落生长的孔进行扩大培养，并传2～4代后及时冻存。一般经过2～3次克隆化操作，就可以获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

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2.3 单克隆抗体的制备结果 采用小鼠腹腔注射的方法制备腹水，经过纯化后对抗体进行液相色谱分析，如图3所示，该抗体在流速1 ml/min时的保留时间是5.760分钟，与图1对比，其分子量约为200 kD左右。

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2.4 单克隆抗体的亚型鉴别 从表1中ELISA结果可以看出，细胞株clone13-2-3与IgG1亚型的二抗反应呈阳性，clone11-4-4与IgG2a亚型的二抗反应呈阳性，说明细胞株clone13-2-3为IgG1亚型，clone11-4-4为IgG2a亚型。

2.5 单克隆抗体的效价 采用间接 ELISA方法对2株杂交瘤细胞产生的抗体效价进行测定。从表2中可以看出，clone13-2-3与clone11-4-4的细胞上清液的OD值与SP2/0细胞上清液的OD值之比大于等于2.1的最高稀释度分别是3 000和2 800。因此，clone13-2-3和clone11-4-4的细胞上清液中单克隆抗体效价分别为1∶3 000和1∶2 800;同理，表3中的实验结果表明，clone13-2-3和 clone11-4-4细胞株制备的腹水中单克隆抗体效价分别达到1∶12 000和1∶7 500。

图1 蛋白分子量标准品液相色谱图Fig.1 The chromatogram of standard substance

图2 纯品r LZ-8的液相色谱图Fig.2 The chromatogram of r LZ-8

图3 r LZ-8单克隆抗体液相色谱图Fig.3 The chromatogram of Mb

图4 Western blot胶片曝光图Fig.4 Film picture of Western blot

表1 杂交瘤细胞亚型检测结果Tab.1 The determination result of their subtype of antibody of hybridoma line

表2 杂交瘤细胞上清液中单克隆抗体效价的检测结果Tab.2 The ELISA result of the monoclonal antibody from hybridoma cell culture

表3 小鼠腹水中获得的单克隆抗体效价的检测结果Tab.3 The ELISA result of the monoclonal antibody from mouse ascites

2.6 单克隆抗体的特异性检测 Western blot胶片曝光方法检测的结果显示，clone13-2-3和clone11-4-4株单抗均能特异性识别rLZ-8蛋白，说明两株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体具有很强的特异性。

3 讨论

本研究在国际相同领域研究中首次以高纯度的rLZ-8作为免疫原反复免疫小鼠，按常规的单克隆抗体制备方法筛选出2株可产生抗rLZ-8抗体的杂交瘤细胞株，并通过制备腹水的方法成功地获得了编号为clone13-2-3和clone11-4-4的单克隆抗体，分别鉴定为IgG1亚型和IgG2a亚型。经ELISA和Western blot检测，这2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均可高特异性地识别rLZ-8，效价分别为1∶12 000和 1∶7 500。

rLZ-8作为一种免疫调节蛋白，不仅能够抑制小鼠系统性过敏反应、刺激人类外周血淋巴细胞增殖和高表达IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子，还对多种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用［5-8］。但在阐释其相关作用机理的研究过程中，包括rLZ-8的细胞亚定位、药效学及药代动力学等研究均需要使用对rLZ-8具有高特异性识别作用的单克隆抗体，因此，其单克隆抗体的成功获得将极大地推进该蛋白的药效学、药理学及其他相关研究的进程。

1 Liang CY，Zhang SQ，Sun F et al.Ganodermalucidumimmunomodulatory protein(Lz-8)expressed in Pichiapastoris and the identification of immunocompetence［J］.Chin JBiotech，2009;25(3):441-447.

2 朱建强，梁重阳，冯 凯et al.重组灵芝免疫调节蛋白的纯化及其性质［J］.高等学校化学学报，2008;29(4):753-756.

3 陈文学，徐根兴，赵 宇et al.抗重组人内皮抑素单克隆抗体的制备［J］.实验与检验医学，2009;27(1):31-32.

4 朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法［M］.北京:人民军医出版社，2000:31-34.

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8 Liang C Y，Zhang SQ，Sun F et al.The dynamic observation:cellular localization of Fluorescein isothiocyanate labeled Recombinant Ganoderma lucidumimmunoregulatoryprotein(rLZ-8)in NB4 APL cell［J］.Chem J Chin Univer，2009;30(3):479-483.