FK506作为佐剂刺激Tfh细胞增强体液免疫水平的研究①

张婧瑶 黄波波 高文娟 杨司韵 孙昕然 张一雪 康友敏

(中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京100193)

Th细胞在免疫反应中起到重要的调节和辅助作用。Th细胞的前体细胞在不同抗原、共刺激分子、细胞因子等促进分化的因素作用下，分化为不同类型的Th细胞而发挥作用。目前已知的有Th1、Th2、Th17、Treg、Th9、Tfh 等几个亚群［1］。其中 Tfh是近年来发现的一群辅助B细胞的主要T细胞亚群，而Th1和Th2所分泌的细胞因子在B细胞活化和Ig类别转换中只起到调节的作用［2］。Tfh细胞表达的CD40L和ICOS与B细胞上的CD40和ICOSL结合，以及通过分泌IL-21，在刺激B细胞的增殖、分化以及免疫球蛋白类别的转换中起着十分重要的作用［3，4］。IL-21在很大程度上加强了由 CD40与其配体CD40L结合诱导的B细胞的增殖，还调节Ig的生成及同型转换［5］。Tfh细胞还表达CXCR5，使它在CXCL13的趋化下，被募集到淋巴滤泡并与B细胞共定位和相互作用。因此，CXCR5成为Tfh迁移、定位重要的“转运分子”，也是Tfh细胞重要的表面标志。目前研究认为Bcl-6是可能控制初始T细胞分化为Tfh的转录因子［6］。因此Tfh细胞相关分子(如ICOS或IL-21)的表达高低很可能与某些自身免疫性疾病或免疫缺陷疾病的发病有关［7］。

他克莫司(Tacrolimus)，又名FK506，大环内酯类物质，是继环孢菌素A(CyclosporinA，CsA)之后国内外器官移植术后临床常规使用的新型免疫抑制剂之一［8］。FK506主要是与细胞性蛋白质(FKBP12)结合，复合物与神经钙调磷酸酶特异性结合以抑制其活性，从而阻滞T淋巴细胞激活过程。FK506也可抑制IL-2、IL-3及IFN-β等淋巴因子的生成及IL-2受体的表达［9］。FK506对于Th细胞的研究多集中于二十世纪八十年代左右，而对于新近发现的Th细胞亚群研究很少。我们的前期研究发现FK506能够抑制Th17而刺激诱导调节性T细胞(Treg)的产生，FK506对于Tfh细胞亚群研究还未见报道［10，11］。本文利用 FK506 作为卵清白蛋白(OVA)的佐剂对其刺激Tfh细胞增强体液免疫反应的机制进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物免疫 雌性BALB/c小鼠(购于中国医学科学院实验动物研究所)，6～8周龄，每组4只。OVA为Sigma产品。每只小鼠皮下注射OVA 100 μg，FK506(Astellas Ireland Co.，Ltd)10 μg，免疫三次，间隔2周。实验有3批小鼠按分组分别进行免疫。

1.2 ELISA 在第三次免疫后7天，收集不同组小鼠血清进行常规的ELISA检测。具体方法如下，用5μg/ml OVA蛋白包被96孔酶标板，4℃过夜;洗涤后用含5%脱脂牛奶封闭1小时;洗涤后加入不同稀释倍数的小鼠血清，37℃孵育1小时;洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃孵育1小时;洗涤后 TMB显色，酶标仪OD450 nm/OD620 nm测定每孔光密度值。实验组血清与阴性对照OD比值大于等于2为阳性，此时的稀释倍数即为抗体滴度。

1.3 细胞表面及细胞因子胞内染色 在第三次免疫后7天，取小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，裂解红细胞后，利用细胞因子胞内染色的方法，1×106细胞加入PMA 50μg/ml和离子霉素100 ng/ml，同时加入莫能霉素(Golgisop产品)于37℃、5%CO2培养箱培养4小时，利用4%多聚甲醛固定，0.1%的皂素破膜后，加入荧光标记的抗小鼠CD4、CXCR5、IL-21的单克隆抗体(购于ebioscience)进行染色，流式细胞仪检测Tfh细胞(CD4+CXCR5+)及分泌IL-21的Tfh细胞(CD4+CXCR5+IL-21+)比例。同时取样品利用抗小鼠B220和IL-21R荧光标记单克隆抗体(购于ebioscience)进行染色，检测B细胞表达IL-21R(B220+IL-21R+)情况，结果以 B220+IL-21R+细胞占B220+细胞比例进行统计分析。

每批免疫小鼠各有1只，在第三次免疫后90天，取小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，裂解红细胞后，加入荧光标记的抗小鼠B220、CD27的单克隆抗体(购于 ebioscience)进行染色、流式细胞仪检测，B220+CD27+B细胞即为记忆性B细胞。

1.4 统计学处理 实验结果用t检验进行统计学分析，P＜0.05差异显著，P＜0.01差异极显著。

2 结果

2.1 FK506作为佐剂显著增强抗体水平 利用FK506/OVA免疫小鼠三次，间隔2周。第三次免疫后7天，收集不同组小鼠血清进行ELISA检测血清中IgG水平。结果如图1所示，FK506/OVA免疫组IgG滴度最高为32 000，OVA单独免疫组IgG滴度为16 000，表明FK506作为佐剂能够显著增强OVA特异性的抗体水平。

2.2 FK506作为佐剂刺激Tfh细胞产生IL-21 利用FK506/OVA免疫小鼠三次，间隔2周。第三次免疫后7天，制备脾脏单细胞悬液进行胞内细胞因子抗体染色，利用流式细胞仪检测CD4+CXCR5+细胞及CD4+CXCR5+IL-21+的比例，结果如图2所示，FK506/OVA免疫组CD4+CXCR5+细胞的比例最高为 10.3%，显著高于 OVA单独免疫组(5.5%)。如图3所示，FK506/OVA免疫组 CD4+CXCR5+IL-21+细胞的比例最高为10.2%，显著高于OVA单独免疫组(6.1%)。表明 FK506作为OVA的佐剂能够增加Tfh细胞及其分泌的IL-21，可能直接作用于B细胞。

图1 FK506对小鼠抗体水平的影响Fig.1 FK506 increased IgG level

图2 FK506诱导Tfh细胞产生Fig.2 The induction of Tfh cells by FK506

图3 FK506刺激Tfh分泌IL-21Fig.3 FK506 stimulated IL-21 expression of Tfh cells

2.3 FK506作为佐剂对B细胞表达IL-21R的影响 Tfh细胞可以分泌IL-21，通过与B细胞表面的IL-21R作用刺激B细胞的增殖及活化，增强体液免疫水平。免疫后的小鼠取脾脏细胞进行B细胞表面IL-21R的表达的检测。如图4结果表明FK506/OVA组B220+IL-21R+显著高于OVA单独免疫组，表明FK506可以增加B细胞表面IL-21R的表达。

2.4 FK506对记忆性B细胞的影响 B细胞被激活后转化为浆细胞分泌抗体，而后大部分细胞凋亡，有一小部分B细胞会转化为记忆性B细胞，待再次遇到抗原后此部分记忆性B细胞很快被活化并分泌抗体。因此我们对FK506对记忆性B细胞的影响进行了检测。B220分子是B细胞的标志，CD27+是记忆性B细胞的特征标记，B220+CD27+B细胞即为记忆性B细胞。结果如图5所示，FK506/OVA组与OVA组相比，B220+CD27+表达显著上升，表明FK506能够增加记忆性B细胞的比例。

图4 FK506增加B细胞表达IL-21RFig.4 FK506 increased IL-21R expression of B cells

图5 FK506对记忆性B细胞的影响Fig.5 FK506 increased the percentage of B cells

3 讨论

FK506是抑制机体免疫反应的药物，主要应用于器官移植排斥反应、自身免疫性疾病及过敏反应的治疗［12，13］。FK506对 T 细胞的抑制作用主要是通过抑制IL-2的产生，即抑制Th1细胞亚群;我们的前期研究发现FK506能够影响Th17的产生及Treg细胞的产生和功能［10，11］。FK506 对于 Tfh 细胞亚群研究还未见报道。本研究通过利用FK506作为模式OVA蛋白的佐剂，首次发现FK506能够增加Tfh细胞亚群的比例并刺激IL-21的分泌，同时B细胞表面IL-21R表达显著升高，表明Tfh细胞可能通过IL-21作用于B细胞，进而增强B细胞的增殖能力及分泌抗体的水平。

疫苗免疫能够刺激机体产生具有抗原专一性的免疫反应，是预防和治疗疾病的重要和有效途径。疫苗免疫能够产生免疫记忆细胞，再次遇到抗原将会在短时间内大量的扩增特异性的免疫细胞，重要的是疫苗免疫能够产生抗原特异性的免疫记忆细胞。本研究首次利用FK506作为模式OVA蛋白的佐剂，发现FK506能够增强记忆性B细胞的比例，进而增强疫苗的体液免疫水平。

综上所述，FK506作为蛋白疫苗佐剂能够刺激Tfh细胞分泌IL-21，作用于B细胞表面的IL-21R，刺激B细胞的增殖及活化，增强抗体水平，本研究为FK506研究拓展了思路。

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