γ-干扰素通过激活 JAK/STAT信号转导途径上调小鼠系膜细胞内HMGB1表达①

陈砚凝 张玉军 吕 欣 刘青娟 刘淑霞 (河北医科大学病理教研室，石家庄050017)

狼疮肾炎(Lupus nephritis，LN)是典型的自身免疫复合物性肾炎，其继发于自身免疫系统疾病-系统红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)，是SLE最重要的并发症之一，也是患者死亡的主要原因［1，2］。至今LN的发病机制尚未明确。但是导致SLE发病的免疫细胞功能异常和细胞因子失衡可能是LN发病的核心。

γ干扰素(IFN-γ)作为可溶性细胞因子二聚体，从属于Ⅱ型干扰素，主要由活化的T细胞和自然杀伤细胞(Natural killer，NK)产生，也可由已建立抗原特异性免疫的CD4和CD8阳性的细胞毒性T淋巴细胞产生，是固有免疫和获得性免疫的重要细胞因子。大量研究表明，IFN-γ的异常表达参与了SLE的发生和发展，是SLE发病过程中重要的细胞因子，在狼疮性肾炎发病早期即出现明显的表达升高［3］。我们前期实验研究发现，狼疮性肾炎小鼠肾组织和血清中高迁移率族蛋白1(High mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1)表达升高，并与肾脏损伤呈正相关性，同时IFN-γ可诱导体外培养的系膜细胞(Mesangial cell，MC)合成和分泌HMGB1［4，5］，但依赖于何种途径，目前尚不明确。

因此本研究在以往实验基础之上，以MMC为实验对象，通过观察IFN-γ是否影响JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 的表达，并分析与HMGB1表达的关系，进一步明确 IFN-γ介导HMGB1升高的可能机制，为阐明狼疮性肾炎发病过程中HMGB1异常表达的分子机制、临床选择有效治疗方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 小鼠系膜细胞MMC本实验室冻存。

1.1.2 培养基 DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司。

1.1.3 主要试剂 IFN-γ和 AG490(美国 Sigma公司);鼠抗β-actin单克隆抗体(石家庄博海生物公司);兔抗 HMGB1多克隆抗体(Abcam);兔抗JAK1，p-JAK1多克隆抗体，鼠抗 JAK2，p-JAK2单克隆抗体(美国Santa Cruz公司);兔抗STAT1多克隆抗体，兔抗p-STAT1多隆抗体(Cell signal technology);辣根酶标记羊抗兔IgG，辣根酶标记羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术公司)，PCR试剂盒(北京全式金生物技术公司);Trizol(USA Invitrigen)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将常规培养的MMC细胞无血清培养24小时后随机分成3组:对照组(N);IFN-γ(500 U/ml) 刺激组(IFN-γ);IFN-γ +AG490(IFN-γ 500 U/ml+AG490 200 μmol/ml)组(IFN-γ+AG490组，AG490预处理后45分钟后加入 IFN-γ)，分别于 0、2、4、6、8、12 小时收集不同时间点细胞。

1.2.2 Western blot 检测系膜细胞中 JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 的表达 收集不同时间点细胞，低温下提取细胞总蛋白和核蛋白(按照说明书操作，购自生工生物)并以紫外分光光度仪定量。等量蛋白(50μg或100μg)进行SDS-PAGE电泳，转膜，以5%脱脂奶粉或BSA 37℃封闭2小时(磷酸化抗体用5%BSA封闭)，一抗4℃过夜，抗体及使用浓度如下:JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 抗 体 浓 度 均 为 1∶500，HMGB1、β-actin抗体浓度均为1∶1 000。TBST 洗膜后以HPR标记的IgG二抗(1∶5 000)37℃封闭2小时，TBST洗膜，ECL化学发光成像。底片透扫后以LabWorks 4.5软件对条带进行定量分析，HMGB1蛋白表达以目的条带和β-actin条带积分光密度值的比值(IOD值)代表目的蛋白的相对表达量;p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1蛋白的表达量以p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1分别和 JAK1、JAK2和 STAT1的比值代表目的蛋白的相对表达量;STAT1核蛋白的表达量以STAT1条带和Histone H3.1条带积分光密度值的比值(IOD值)代表。

1.2.3 RT-PCR检测细胞中HMGB1 mRNA表达

Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量。取等量RNA，以M-MLV反转录为cDNA，TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增，引物序列见表1。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后进入凝胶图像分析系统(美国UVP公司)进行吸光度扫描，以管家基因β-actin作为内参照校正，用目的基因的吸光度和β-actin吸光度的比值作为目的基因的相对表达含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件处理，所有计量资料以±s表示，两组间比较采用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-γ能够促进小鼠系膜细胞JAK、STAT1磷酸化 经条带扫描，LabWorks5.0 分析，IFN-γ 刺激组(IFN-γ group)的细胞在 0、2、4、6、8、12 小时各时间点p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1的蛋白表达较正常培养组升高(图1B、C)，差异具有统计学意义(P＜0.05);各时间点之间相比，非磷酸化JAK1、JAK2和STAT1蛋白表达未见明显区别(图1B)，但p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1蛋白表达随着刺激时间的延长，表达增强，呈时间依赖性。在(IFN-γ+AG490)组0、2、4、6、8、12 小时时 p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1 蛋白表达较IFN-γ刺激组(IFN-γgroup)明显降低，并呈时间依赖性，差异有统计学意义(图1D、E)。

表1 引物序列及PCR反应条件Tab.1 Primer sequences and PCR reactive conditions

2.2 IFN-γ促进系膜细胞STAT1蛋白核转位 提取细胞的核蛋白，采用Western blot技术，以Histone H3.1为内参照，结果显示，IFN-γ能够上调系膜细胞核内STAT1蛋白的表达，并随着刺激时间的延长，表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.05，图2A、B)。Western blot结果亦显示，AG490预处理IFN-γ 刺激后(IFN-γ +AG490)在 0、2、4、6、8、12 小时STAT1核蛋白表达明显低于IFN-γ单独刺激组(IFN-γgroup)，并呈时间依赖性，差异有统计学意义。

2.3 IFN-γ能够上调系膜细胞中HMGB1 mRNA及蛋白表达 与正常对照组相比，IFN-γ能够上调系膜细胞中HMGB1mRNA及蛋白表达，并随着刺激时间延长，其相对表达量呈上升趋势，见图3。

图1 Western blot检测p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1蛋白在不同组系膜细胞内的表达Fig.1 The expression of p-JAK1，JAK1，p-JAK2，JAK2，p-STAT1 and STAT1 protein in the MC cells by Western blot

图2 Western blot检测STAT1在不同组系膜细胞核蛋白内的表达情况Fig.2 The expression of STAT1 nuleoprotein in the MC cells by Western blot

图3 不同组系膜细胞HMGB1在mRNA和蛋白的表达Fig.3 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the MC cells of different group by RT-PCR and Western blot

2.4 AG490能够降低IFN-γ诱导的HMGB1 mRNA及蛋白表达上调 为了明确JAK/STAT信号途径是否参与IFN-γ诱导的HMGB1表达升高，我们采用用JAK特异性抑制剂AG490处理细胞，结果显示:AG490处理后，IFN-γ刺激不能引起细胞内JAK磷酸化，STAT1蛋白的核转位显著降低，同时系膜细胞中HMGB1 mRNA及蛋白表达较IFN-γ组降低，并随时间延长而下调，见图3，差异具有统计学意义。

3 讨论

狼疮肾炎(LN)是危害系统性红斑狼疮(SLE)病人生命的重要并发症之一。目前，虽然SLE详细发病机制尚未明确，但公认的免疫细胞功能异常和细胞因子失衡是SLE发病机制的核心。IFN-γ是SLE发病过程中重要的细胞因子，具有促进发病，加重病情的双重作用，并与肾脏损伤密切相关。IFN-γ从属于Ⅱ型IFN，在先天性和获得性宿主免疫反应中发挥着重要作用;其能够有效抑制细菌和病毒增殖，并调控细胞凋亡;同时IFN-γ还参与针对一些细胞内病原体的宿主免疫反应，虽然IFN-γ绝大多数在激活的T淋巴细胞和NK细胞中产生，但是IFN-γ受体存在于大多数细胞中。IFN-γ对细胞的刺激可以引起STAT1蛋白聚集到IFNγRⅠ受体链的单个STAT1结合位点上，进而可被JAK1/JAK2激活，之后STAT1从受体上游离、形成二聚体，进入细胞核内，与GAS(gamma activated site)增强子家族结合参与信号转导。本实验研究以小鼠肾脏系膜细胞(MC)为模型，以IFN-γ为刺激物，发现在刺激后出现JAK1、JAK2、STAT1的磷酸化和 STAT1的核输入，同时伴有细胞中HMGBmRNA和蛋白表达升高，推断 JAK/STAT1的活化参与了 IFN-γ介导的HMGB1 表达。Rendon-Mitchell等［7］在 RAW 264.7 cells发现STAT1可以诱导高迁移率族蛋白1(High mobility group protein box1，HMGB1)表达［8］。

为了进一步证实在IFN-γ刺激的系膜细胞中JAK/STAT激活与HMGB1表达上调之间的确切关系，我们采用JAK特异性抑制剂AG490预处理细胞，旨在观察抑制了JAK信号通路后是否降低IFN-γ诱导的HMGB表达，Western Blot结果显示，采用AG490预处理后，IFN-γ刺激组 p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1表达明显下降，同时HMGB1mRNA及蛋白表达均下调，因此我们认为IFN-γ可磷酸化Janus kinase(JAK)/signal transducer and activators of transcription(STAT)信号通路，并促进STAT1入核，激活下游信号通路，诱导HMGB1表达，如图4所示。

综上所述，IFN-γ可以刺激体外培养的小鼠系膜细胞合成HMGB1，其机制可能与JAK/STAT信号途径的活化有关。其合成后如何介导狼疮性肾炎的发生，将有待于进一步研究!

图4 IFN-γ调控HMGB1表达的模式图Fig.4 Ideograph of HMGB1 expression regulated by IFN-γ

1 刘 允，杨海峰，王立新et al.狼疮性肾炎病理与临床特征相关性研究:49例报告［J］.南方医科大学学报，2010;30(8):1915-1917.

2 Perry D，Sang A，Yin Y.Murine models of systemic lupus erythematosus［J］.JBiomed Biotechnol，2011;doi:10.1155/2011/271694.

3 Segal R，Dayan M，Globerson A et al.Effect of aging on cytokine production in normal and experimental systemic lupus erythematosus afflicted mice［J］.Mech Ageing Dev，1997;96(1-3):47-58.

4 刘淑霞，郝 军，郭惠芳et al.TLR4介导高迁移率族蛋白致系统性红斑狼疮肾损害的作用研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2008;28(12):1079-1083.

5 刘淑霞，郭惠芳，郝 军 et al.INF-γ对体外培养的系膜细胞HMGB1和MMP-2表达的影响［J］.吉林大学学报医学版，2009;35(1):47-50.

6 Carneiro J R，Fuzii H T，Kayser C et al.IL-2，IL-5，TNF-α and IFN-γmRNA expression in epidermal keratinocytes of systemic lupus erythematosus skin lesions［J］.Clinics(Sao Paulo)，2010;66(1):77-82

7 Rendon-Mitchell B，Ochani M，Li J et al.IFN-gamma induces high mobility group box 1 protein release partly through a TNF-dependent mechanism［J］.JImmunol，2003;170(7):3890-3897.

8 Ek M，Popovic K，Harris H E et al.Increased extracellularlevels of the novel proinflammatory cytokine high mobility group box chromosomal protein 1 in minor salivary glands of patient's with gren's syndrome［J］.Arthritis Rheum ，2006;54(7):2289-2294.