钩藤生物碱抑制高血压大鼠主动脉胶原沉积及对基质金属蛋白酶的影响

姜月华，孙敬昌，周洪雷，王永瑞，李运伦

(1.山东中医药大学附属医院，山东济南 250011;2.山东中医药大学，山东济南 250355)

钩藤碱(rhynchophylline)和异钩藤碱(isorhynchophylline)是从中药材钩藤中分离、提纯的生物碱，是钩藤发挥降压效应的主要成分。前期研究表明钩藤碱和异钩藤碱能降低自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rats，SHR)胸主动脉和肠系膜动脉中膜厚度/管腔直径比值，改善胸主动脉和肠系膜动脉病理组织学损害［1］，调控SHR胸主动脉平滑肌细胞的凋亡，抑制胸主动脉平滑肌细胞的增殖［2－3］，但钩藤碱和异钩藤碱能否抑制SHR动脉壁胶原的沉积及作用机制尚不清楚。本文研究钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱(Uncaria alkaloids)对SHR胸主动脉Ⅰ型胶原(Collagen typeⅠ，ColⅠ)和Ⅲ型胶原(CollagentypeⅢ，ColⅢ)的影响，并进一步观察其对动脉壁基质金属蛋白酶(marix metalloproteinase，MMP)-9、MMP-2以及其组织抑制因子(tissue inhititor of metalloproteinase，TIMP)-2 的作用，探讨其可能存在的抗高血压动脉胶原重塑的机制，从而为钩藤生物碱的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ♂SHR 40只，8周龄，体质量192～217 g，由北京维通利华实验动物中心提供［许可证:SCXK(京)2006-0009］;♂Wistar大鼠8只，8周龄，体质量196～220 g，山东中医药大学实验动物中心提供［许可证:SCXL(鲁)20051015］。

1.2 试剂与材料 钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱:由山东中医药大学药学院周洪雷教授提供，纯度分别为0.997、0.997 和 0.80，用前经 0.1 mol·L－1HCl溶解后，分别用蒸馏水稀释为0.5、0.5和5 g·L－1，调pH至7.2。置4℃冰箱保存备用，使用前振荡，充分摇匀。卡托普利(captopril):济南东风制药有限公司，鲁药准字(2001)第027510号，生产批号0208023，25 mg/片。实验前加适量生理盐水，配制成1.75 g·L－1的混悬液，置4℃冰箱保存备用。即用型SABC免疫组化染色检测试剂盒、ColⅠ兔多抗IgG、ColⅠmRNA原位杂交检测试剂盒、ColⅢ兔多抗IgG、ColⅢ mRNA原位杂交检测试剂盒、DAB显色剂、生物素化山羊抗兔IgG，武汉博士德生物工程有限公司。MMP-9鼠单抗 IgG、MMP-2鼠单抗 IgG、TIMP-2鼠单抗IgG、MMP-9原位杂交检测试剂盒、TIMP-2原位杂交检测试剂盒，北京中杉金桥生物制品有限公司产品。

1.3 动物分组给药 将SHR随机分为5组:模型组、卡托普利组、异钩藤碱组、钩藤碱组和钩藤总生物碱组。Wistar大鼠8只作为正常组。卡托普利组给药量为每天17.5 mg·kg－1，异钩藤碱组、钩藤碱组和钩藤总生物碱组的给药量分别为每天5、5和50 mg·kg－1，模型组和正常组给予等容量生理盐水。给药容积为每次10 ml·kg－1，灌胃给药，每周给药6 d，每天下午定时给药，连续8周，并随体质量变化调整给药量。

1.4 动脉留取 末次用药24 h后，禁食12 h(不禁水)，用质量浓度为0.02 g·L－1的戊巴比妥钠2 ml·kg－1体重腹腔注射麻醉，下腔静脉取血。取血后立即从颈静脉穿刺插管，用4℃生理盐水约50 ml快速灌注冲洗，待冲洗液无色后，快速分离、摘取胸主动脉，分为2份:一份用体积分数为0.1的甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组化检测;一份用体积分数为0.04的多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于原位杂交检测。

1.5 胸主动脉胶原的定性检测 采用Masson染色法。

1.6 胸主动脉 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9、MMP-2 和TIMP-2的蛋白表达检测 采用免疫组织化学SABC法:石蜡切片脱蜡至水，体积分数为0.03的H2O2室温10 min，PBS洗5 min×3次，微波修复抗原，体积分数为0.05的BSA封闭20 min，滴加亲和纯化ColⅠ兔多抗IgG或ColⅢ兔多抗IgG或MMP-9鼠单抗IgG或TIMP-2鼠单抗IgG(1∶100倍稀释)，湿盒内37℃ 1 h，PBS代替一抗作为阴性对照，PBS洗2 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，37℃20 min，PBS洗 2 min ×3 次，滴加试剂 SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次，DAB显色，镜下控制时间，蒸馏水洗涤，脱水，透明，中性树胶封片。任选5个视野用Image-Pro Plus 4.5图像分析软件对结果进行半定量分析，测定平均灰度，以均值作为该样本ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的相对表达量。

1.7 胸主动脉 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的mRNA表达检测 采用原位杂交法，严格按照试剂盒说明进行操作。并用Image-Pro Plus 4.5图像分析软件对结果进行半定量分析，测定平均灰度，以此作为该样本 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组胸主动脉和肾动脉胶原含量的定性检测在Masson染色下胶原纤维呈绿色。正常组大鼠胸主动脉、肾动脉壁存在胶原纤维表达，而SHR模型组大鼠胸主动脉、肾动脉壁胶原纤维表达较强，绿色表现较重。与模型组比较，各用药组胸主动脉、肾动脉壁胶原纤维表达均有不同程度的减轻，绿色表现有不同程度变浅。见Fig 1。

Fig 1 Masson staining of thoracic aorta

2.2 各组胸主动脉ColⅠ和ColⅢ的蛋白表达检测如Tab 1示，与模型组相比，钩藤碱组、异钩藤碱组和钩藤总生物碱组大鼠胸主动脉Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白质表达、mRNA表达均降低(P＜0.05)。

2.3 各组胸主动脉MMP-9、MMP-2、TIMP-2蛋白表达的比较 如Tab 2示，与模型组相比，钩藤碱组、异钩藤碱组和钩藤总生物碱组大鼠胸主动脉MMP-9和MMP-2蛋白质表达均升高(P＜0.01)，而TIMP-2蛋白质表达均降低(P＜0.05)。与模型组相比，大鼠胸主动脉钩藤碱组、异钩藤碱组和钩藤总生物碱组MMP-9 mRNA表达均升高(P＜0.01～0.05)，而TIMP-2 mRNA表达均降低(P＜0.05)。

3 讨论

胶原在人类和动物血管组织中普遍存在，是血管壁细胞外基质的主要成分，占细胞外基质含量0.8～0.9，其中又以Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原为主。胶原除了作为血管壁的支撑材料外，还可以影响血管壁的组织结构。在高血压的病理进程中，大动脉壁胶原的合成与降解相伴行，正由于大动脉壁胶原过度合成、降解不足、合成与降解之间的动态平衡被打破，导致大动脉壁胶原异常沉积［4－5］。因此，促进大动脉壁胶原降解，抑制大动脉壁胶原合成不仅是抗大动脉壁胶原沉积的基本策略，同时也是抗高血压血管重塑的重要目标。

Tab 1ColⅠand ColⅢprotein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

Tab 1ColⅠand ColⅢprotein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

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Tab 2MMP-9 and TIMP-2 protein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

Tab 2MMP-9 and TIMP-2 protein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

?

自发性高血压大鼠是筛选抗高血压药物最适宜的动物模型，且出现血管周围间质胶原纤维明显增生、血管中膜增厚、管壁厚度增加、弹性纤维板部分断裂等大动脉硬化的表现［6－7］，故本实验以SHR胸主动脉作为高血压大动脉胶原沉积模型，探讨钩藤生物碱在降低血压的同时对SHR胸主动脉胶原沉积的影响，分析Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的特征。结果显示SHR胸主动脉存在胶原沉积、胸主动脉ColⅠ、ColⅢ蛋白表达及 ColⅠmRNA、ColⅢ mRNA转录增多，经钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱干预，SHR胸主动脉胶原沉积减轻，胸主动脉ColⅠ、ColⅢ蛋白表达及ColⅠmRNA、ColⅢ mRNA转录均降低，表明钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱有抑制SHR胸主动脉的胶原沉积的效应，其机制与下调SHR胸主动脉壁ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA的表达有关。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一组依赖Zn2+并以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分为水解底物的蛋白水解酶，MMPs通过对ECM成分的水解，影响其水解与重组的动态平衡，MMP-2和MMP-9是MMPs的重要成员;MMPs的组织抑制因子(tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases，TIMPs)是MMPs的天然抑制剂，TIMP-2是TIMPs家族的重要成员。在病理状态下，TIMPs水平改变直接影响MMPs活性的高低。MMPs及其抑制剂TIMPs调控细胞外基质的代谢，两者的动态平衡维持血管的正常形态和功能，动脉壁MMP-9和MMP-2异常表达参与了高血压病早期血管重塑的病理进程［8－14］。本实验发现，在SHR胸主动脉存在MMP-9和MMP-2蛋白和mRNA低表达、TIMP-2蛋白和TIMP-2 mRNA高表达现象，经钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱干预后，SHR胸主动脉MMP-9和MMP-2蛋白和mRNA表达上调，TIMP-2蛋白和mRNA表达下调。从而表明钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱可通过上调MMP-9和 MMP-2蛋白和 mRNA表达、下调TIMP-2蛋白和mRNA表达来抑制SHR胸主动脉胶原沉积效应。

综上所述，钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱对SHR胸主动脉胶原沉积具有抑制作用，其机制与下调SHR胸主动脉壁ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA表达有关，更深入的机制与上调MMP-9蛋白和mRNA表达、上调MMP-2蛋白表达、下调TIMP-2蛋白和mRNA表达有关，体现了中药多途径、多靶点及整体调节的优势，从而可以推断钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱对防治高血压大动脉硬化的发生发展具有积极的意义。至于钩藤生物碱抑制胶原沉积的机制是降低血压继发的胶原抑制效应还是独立于降压效应之外的靶向性胶原抑制效应抑或是二者兼有，尚有待于进一步探讨。

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