MicroRNAs对动脉粥样硬化关键信号分子的影响

袁绪胜，戴 敏，2，3

(1.安徽中医学院药学院，2.安徽省中药研究与开发重点实验室，3.省部共建新安医学教育部重点实验室，安徽合肥 230031)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性、增殖性和血管炎性疾病［1］，以血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)受损、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增生为主要病理特征［2］。VECs的激活与损伤发生在血管炎症的始动阶段，VECs极易受到周围有害因素，如:氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和高糖等的影响而发生功能和结构的改变［3］。当血管受到损伤时，VECs分泌功能失调，通过产生的细胞炎性因子、生长因子等活性物质影响VSMCs增殖的信号，改变VSMCs基因的表达［4］，导致中膜VSMCs的功能、结构发生改变，从中膜移行穿过内弹力板进入内膜并发生增殖［5］。

microRNAs(miRNAs)是一类生物进化过程中高度保守的，由内源基因编码的，含21～24个核苷酸的非编码单链RNA分子。miRNAs通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译，调控人类20% ～30%的基因表达［6］。miRNAs在心血管系统中调控信号转录后的基因表达，在AS形成和发展的炎症机制中，miRNAs参与VECs激活与损伤过程的信号通路的磷酸化、信号的转导和VSMCs的表型转化、增殖与迁移［7］。本文从VECs损伤和VSMCs增殖与迁移的角度来综述miRNAs对AS关键信号分子的影响。

1 miRNAs调控基因的表达和AS

miRNAs作为一种基因表达的调控因子，在AS发生与发展过程中高表达。miRNAs通过其靶点，调控各种细胞因子、炎性分子等表达进而直接或间接影响AS的病理进程。脂质沉积于血管内皮下能够损伤VECs，伴随着单核－巨噬细胞浸润与吞噬，泡沫细胞的产生以及炎症介质分泌增多，最终导致 AS形成［8］。Xu等［9］最早发现 miRNAs与血脂之间的关联，新近研究表明miRNAs是脂质代谢的调节因子。miRNA-14沉默组动物的甘油三酯和甘油二酯升高，而增加miRNA-14表达后，其血脂水平便可恢复正常，表明miRNA-14具有降低血脂的作用。采用反义寡核苷酸抑制miRNA-122，可明显降低正常小鼠体内血浆中胆固醇水平，而对肥胖小鼠模型，不仅降低血浆胆固醇水平，还改善肝脏的脂肪变性［10］。

miRNAs可以从不同水平上调节基因表达，起到类似蛋白质的调节作用。miRNAs在血管细胞内调节多种重要作用。在胚胎发育过程中，miRNAs可促进血管发育，miRNAs表达失调会导致血管发育异常。最早的证据为Dicer敲除的小鼠表现出明显的血管新生缺陷［11］。此后的研究表明涉及血管表达的miRNAs通过影响VECs、VSMCs等的功能来调控血管发育。

miRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNAs表达的时序性和组织特异性提示miRNAs的分布可能影响组织和细胞的功能特异性，也可能参与复杂的基因调控过程，对组织的发育起重要作用。一些特异性的表达于心血管系统的miRNAs参与心血管的发育及疾病发生过程，通过体内外实验确认其部分靶基因，提供了分子层面研究miRNAs功能的方法［12］。在 AS形成的过程中，多种miRNAs特异性的调控血管细胞因子、炎性因子等的表达，影响血管壁的功能与结构。同时，由于miRNAs与靶基因间存在着复杂的调控网络，精细的调控着血管壁上基因的表达［13］，通过miRNAs调控基因的表达，将稳定斑块、延缓AS斑块进展，进而减少心血管事件。

大多数miRNAs与靶mRNA的3'非翻译区(untranslated region，UTR)结合，部分miRNAs与开放阅读框(open reading frame，ORF)或5'UTR结合，抑制靶mRNAs的翻译或降解靶mRNAs，抑制的程度和 miRNAs结合位点的数目有关［14］。miRNAs通过与靶基因的3'UTR上的靶序列结合，发挥其基因沉默效应［15］，从转录后水平对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用。miRNAs参与了血管细胞的发育、损伤、凋亡、增殖等多种生物学过程，它的表达在多种心血管系统生理病理过程中也具有重要的调控作用［16］。尽管大多数miRNAs的功能未知，但新发现的miRNAs对基因表达的调控，可能提供研究AS等心血管疾病病理机制新视角。

2 miRNAs和VECs信号分子

当外界因素损伤或激活VECs，细胞的通透性增加，表面的黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和E-选择素等)表达增加，VECs表面黏附力增强，而使其发生凋亡［17］。血液中的单核细胞易黏附并迁移入血管内膜，进入内膜后的单核细胞增殖分化为巨噬细胞，表达清道夫受体并介导摄取脂蛋白而变成泡沫细胞，产生氧自由基、炎性细胞因子以及蛋白酶等介导的免疫反应。

miRNAs参与并调控VECs激活与损伤过程。miRNAs主要通过调节血管内皮功能和结构的完整性、细胞炎性因子和黏附分子的表达、VECs的增殖与迁移和参与血管形成的能力等途径实现对VECs的作用。当外界因素刺激VECs时，miRNA-21、miRNA-125a、miRNA-126、miRNA-221 和 miRNA-222等多种miRNAs在VECs中高水平表达［18］。

VECs中存在较丰富的miRNA-21，但涉及miRNA-21生物学意义的相关研究很少，Ji等［19］采用大鼠颈动脉球囊损伤模型观察了血管损伤后miRNAs的变化规律，发现球囊损伤后血管组织中miRNA-21表达明显上调。采用反义寡核苷酸敲除miRNA-21可抑制颈动脉内膜球囊损伤后的血管内膜增生，说明miRNA-21能够促进血管内膜的增生。miRNA-125a调控炎症性细胞因子的表达水平，其抑制ox-LDL刺激的巨噬细胞对脂质的摄取，并减少炎症因子如 IL-2、IL-6、TNF-α 等的分泌与释放［20］。miRNA-126与 VECs的损伤修复具有紧密的联系，Wang等［21］研究表明内皮细胞特异性的miRNA-126通过增加VECs生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)的表达，抑制负调控基因Spred-1的表达而促进血管形成。敲除miRNA-126基因，新生小鼠VECs增殖、迁移受限，导致血管内膜不完整，血管形成障碍。VCAM-1是miRNA-126的靶基因，降低 miRNA-126的表达水平，会导致TNF-α诱导的VCAM-1表达上调，从而促进单核细胞在VECs的黏附［22］。miRNA-221和 miRNA-222对内皮祖细胞具有调节作用，同时参与内皮细胞的增殖与分化，在VECs损伤后修复过程中发挥着重要的调控作用［23］。

3 miRNAs和VSMCs信号分子

VECs损伤与激活后，释放细胞炎性因子、生长因子等，这些活性物质通过受体，激活VSMCs，使其由收缩表型转化为合成表型，增殖由中膜向内膜迁移，吞噬脂质转化为泡沫细胞。在AS形成与发展的过程中，miRNA-21、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-155、miRNA-221 和 miRNA-222 等 在VSMCs中特异性的表达，调控VSMCs表型的转化、增殖与迁移，影响 AS 的形成［24］。

在体外培养的VSMCs中miRNA-21表达增加，通过下调靶基因程序性死亡因子4(PDCD4)的表达，调节VSMCs收缩表型相关基因的表达，参与骨形态发生蛋白诱导的VSMCs收缩表型的转变［25］。LiuY 等［26］报道过氧化氢处理VSMCs后可引起miRNA-21表达明显上调，miRNA-21过表达可减少细胞凋亡，而miRNA-21抑制后增加过氧化氢诱导的VSMCs死亡和凋亡。miRNA-21通过调节VSMCs中PDCD4及激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)途径发挥对抗过氧化氢损害的平滑肌细胞保护效应。血管内膜增生是AS病变中内膜损伤的表现，miRNA-21是内膜增殖的重要调控因子，抑制miRNA-21可能通过作用B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)和磷酸酶基因(PTEN)抑制血管内膜增生。miRNA-21的抑制剂可以剂量依赖性的诱导细胞凋亡，减少细胞增殖［27］。

Cordes等［28］确认 miRNA-143和 miRNA-145分别作用于转录因子EIK-1(Ets-like transcription factor-1)和细胞周期抑制因子KFL-4，体外试验证明miRNA-143和miRNA-145通过抑制平滑肌细胞增殖，促进细胞的分化，在VSMCs的命运决定和可塑性方面发挥关键的作用。Cheng等［29］报道了过表达miRNA-145通过抑制KFL-5的表达抑制大鼠颈动脉球囊损伤造成的内膜新生。

miRNA-155作为免疫细胞中重要的调控因子在VSMCs中也有表达。血管紧张素II-1型受体(AT-1R)是miRNA-155的一个靶基因，AT-1R激活后可促进VSMCs的增殖和迁移，因此miRNA-155可能通过抑制AT-1R的表达抑制血管紧张素 II(AngII)信号介导的血管增生过程［30］。Zhang等［31］研究表明，大鼠颈动脉损伤及血管成形术后，miRNA-21和miRNA-221、miRNA-222在受损的动脉平滑肌细胞中大量表达，损伤处血管平滑肌增生，管腔狭窄。下调miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222的表达，明显抑制了VSMCs的增殖。进一步研究发现，miRNA-221和miRNA-222通过调节p27和p57基因的表达，抑制VSMCs的增殖效应。

4 miRNAs在信号分子介导通路中的调控作用

miRNAs通过负性调节特异性的靶基因，参与VECs和VSMCs信号分子的活化与转导，发挥细胞活性的调节作用。Cui等［32］发现，近30%的信号网络蛋白为miRNAs的靶基因，而在人类基因组中，miRNAs的靶基因仅占总基因数的17%左右，这提示miRNAs更倾向于选择信号转导通路上的蛋白为靶向，因而在信号调控方面扮演着更为重要的角色。Yoo等［33］的研究首次提及miRNAs参与到信号分子介导的通路中并能影响细胞的分化转归，他们阐述miRNA-61与细胞表面的受体LN-12/Notch及短日节奏基因VAV-1之间的相互联系，它调控体内与细胞的发育分化有关的信号分子。miRNA-61与基因VAV-1的mRNA 3'UTR互补，抑制VAV-1蛋白的表达，受VAV-1抑制的LN-12活性反而增高，这样LN-12、miRNA-61及VAV-1形成了一个反馈环，使得LN-12的活性最大化。

miRNAs在免疫炎症细胞因子信号转导的过程中发挥重要的调节作用。用LPS刺激人单核细胞系巨噬细胞株(THP-1)后，用芯片技术检测200个成熟miRNAs的表达，发现 miRNA-132、miRNA-146和 miRNA-155的表达水平升高［34］。进一步研究miRNA-146对Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)配体和一些细胞因子刺激的反应情况，结果显示TLR2、TLR4和TLR5的配体可以明显刺激miRNA-146表达上调［35］，miRNA-146是通过TLRs信号传导通路负反馈调控机制下调参与炎症反应［36］。利用微阵列技术研究TLRs信号通路活化后淋巴细胞miRNAs的表达情况，发现TLR2、TLR4和TLR9的配体都能够依赖不同的衔接蛋白活化核因子NF-κB和AP-1，引起miRNA-155的积累，干扰素(interferon，IFN)-β 则需首先增强 TNF-α 的合成，通过 TNF-α 自分泌途径活化自身JNK信号通路，进而刺激miRNA-155的产生［37］。

在刺激细胞的胞内信号传导途径中，研究较多的是丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)，它在细胞反应中起着重要作用。在哺乳动物细胞中至少己克隆了 ERK、JNK、p38和NEK 4个 MAPK 亚族，其他包括 NF-κB、PKC、PI3K、G 蛋白等信号传导途径在内毒素激活细胞中也起重要作用。miRNA-101可以通过靶向丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)mRNA的3’UTR来调节MAPK的反应，进而影响下游炎症因子的分泌。PI3K/AKT通路通过调控miRNA-101的表达，影响MKP-1以及MAPK的表达和活化情况，这表示PI3K/AKT通路可以通过miRNA-101与MAPK通路进行串扰［38］。若miRNA-101被抑制，导致MKP-1大幅度上调而降低了MAPK活化作用。同时，miRNA-126通过抑制血管新生的负调控因子Spred-1和PI3K受体的表达参与血管新生信号转导，参与损伤血管细胞的修复，维持血管完整性。

由此可见，miRNAs对细胞信号分子通路的调节作用是多种多样的，它既可以通过关闭一些关键基因来影响细胞的增殖、分化和转归，也可能与其靶基因产物相互作用形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。

5 结语与展望

miRNAs作为一类具有重要调控作用的内源性小RNA分子，通过调节靶基因mRNAs的稳定性或抑制翻译而发挥作用，使miRNAs成为新的治疗措施。明确各种miRNAs的直接靶标以及不同组织中的特异性miRNAs，进一步寻找并验证靶基因是阐明miRNAs功能与作用机制的一个重要方面。尽管现在已开发出多种生物信息学分析软件可以预测miRNAs的潜在靶基因，然而仅有少数一些靶基因被验证。miRNAs在AS形成的炎症机制中扮演着重要角色，但 miRNAs和AS形成与发展关系的研究尚处在起步阶段，哪些miRNAs在AS发生发展过程中发挥调控作用?它们是如何发挥相互作用共同组建调控网络的?一系列问题还有待深入探讨。研究miRNAs对AS病理的调控影响和作用机制，有助于我们从新的领域和视角认识心血管系统相关的生理、病理变化过程，为AS病理机制的研究找到新的切入点，为研发抗AS新药开拓新的思路。

近年来，尽管miRNAs在心血管疾病中作用的研究取得了令人瞩目的成果，证实miRNAs参与调控心血管系统多种相关蛋白的表达，但miRNAs在心血管系统中的生物学行为仍然是新的研究领域，miRNAs在心血管系统中的作用靶点和作用机制尚待发现，需要挖掘不同心血管疾病中miRNAs的表达模式、调控的靶基因以及参与的信号通路等。把计算机分析技术、生物信息学、细胞生物学和功能基因组学等先进科学技术方法相互结合，将有助于推动miRNAs在心血管疾病中的研究，丰富我们对心血管生理和病理方面的认识，并将推动和扩展心血管疾病治疗思路与方法的研究。

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