蛋白质巯基亚硝基化与神经退行性疾病

齐孟和，胡金凤，宁 娜，云彩麟，陈乃宏

(1.天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京 100050;2.内蒙古医学院药学院药理学教研室，内蒙古呼和浩特 010059)

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种重要的生物信使分子，最早发现它的作用是作为心血管系统中的内皮细胞舒血管因子。后来研究逐渐发现它在中枢神经系统中可作为一种神经递质和信号分子来发挥效能，参与多种生理、病理过程。Stamler等［1］发现NO及其衍生物可以通过修饰蛋白质巯基的方式而稳定发挥其生物活性，由此明确了蛋白质巯基亚硝基化(S-nitrosylation，SNO):NO及其衍生物作用于蛋白质半胱氨酸残基(cysteine，Cys)的巯基(-SH)，使之生成-SNO。后续研究陆续发现了超过100种可发生SNO的底物［2］。近年来，由NO介导的蛋白质SNO导致神经退行性疾病发生已经成为一个重要假说，成为研究神经退行性疾病关注的热点。

内源性NO是由其前体物质左旋精氨酸(L-arginine，LArg)与O2在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化作用下生成的:L-Arg接受还原氢(NADPH)提供的电子，并在Ca2+/CaM的协助下，发生羟化反应生成中间产物N-ω-羟精氨酸，然后在NADPH和四氢生物蝶呤(BH4)的协助下，经NOS作用，进一步氧化生成NO和L-胍氨酸(L-citrulline)［3］。体内众多组织都可以生成NO，这是因为组织细胞内均存在NOS，并且大脑中NOS的活性要高于其它任何组织。目前发现的 NOS有 3 种亚型［4］:神经元型(nNOS/NOS1)、诱导型(iNOS/NOS2)、内皮细胞型(eNOS/NOS3)，虽然3种亚型的NOS均参与NO的产生，但是由于特定的细胞分布和转录调控，它们在病理和生理情况下的作用也是不同的。目前认为，eNOS产生的NO具有神经保护作用，而nNOS和iNOS激活产生过量的NO则具有神经毒性作用。

内源性NO发挥功能途径之一是通过蛋白质巯基亚硝基化的方式。在神经系统中，NO可促使一些特殊靶蛋白发生巯基亚硝基化，从而影响神经元的活性和功能［5］。其中大部分蛋白质的巯基亚硝基化会诱导神经元凋亡或死亡，但是也有部分蛋白如p21Ras、Bcl-2、Caspase-3等巯基亚硝基化可阻止细胞死亡而起到神经保护作用［6］。因此，蛋白质巯基亚硝基化对神经细胞存活起到损伤作用还是保护作用，需要考虑其在脑组织中的功能水平、分布位置和形成阶段等综合效应。

神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)是一种以神经元退行性变为基础的慢性进行性神经系统疾病，主要包括阿尔采末病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)及亨廷顿病(Huntington's disease，HD)等疾病。现研究已发现在多种神经退行性疾病患者的脑组织中可以普遍观察到硝化蛋白的聚集，蛋白质巯基亚硝基化修饰究竟是如何参与了这些疾病的发生、发展?这成为学者们研究的热点，现将近年来研究进展概述如下。

1 蛋白质巯基亚硝基化与AD

AD是一种以记忆力减退、认知障碍为主要特征，多发于中老年人的神经退行性疾病，其主要的病理学特点是:β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques，SP)，神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及特定脑区胆碱能神经元与突触的缺失。近期发现，蛋白质巯基亚硝基化与AD的病理机制存在诸多广泛的联系。

1.1 发动蛋白相关蛋白1巯基亚硝基化与AD 发动蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是一个可以调解线粒体分裂的重要蛋白质。Cho等［7］研究发现，Drp1氨基酸序列644位点的半胱氨酸残基是发生SNO的位置，SNODrp1增加其二聚体形成和促进Drp1的GTP酶活性，这些都是线粒体裂变必须的，从而导致线粒体过度分裂。另外还发现，暴露于Aβ寡聚体的Drp1会形成SNO-Drp1而导致突触丢失，这证明Aβ寡聚体也可促进Drp1的巯基亚硝基化，从而促进线粒体裂变和神经元损伤。最近报道［8］，nNOS在Aβ的形成过程中起到淀粉样催化剂的作用。这些研究都表明，在AD的发生发展过程中，nNOS-NO-SNO-Drp1-Aβ这个复杂的相互影响的网络调控体系是对AD脑神经毒性作用的重要机制之一。

1.2 载脂蛋白E巯基亚硝基化与AD 载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)对于迟发型AD是一个非常明显的遗传易感因子，同时也是对中枢神经元结构的维持和重建有不可替代的作用。其在脑内有3种不同的亚型:ApoE2、ApoE3和ApoE4，3者的差异只是在氨基酸序列112与158位点上的半胱氨酸(Cys)与精氨酸(Arg)的区别，ApoE2的两个位点均是Cys，ApoE3的两个位点各有一个Cys和 Arg，ApoE4的两个位点均是Arg。Abrams等［9］研究发现，在nNOS稳定过表达的HEK-293细胞模型中，ApoE2与ApoE3可被巯基亚硝基化，而ApoE4不能被巯基亚硝基化。又因ApoE2纯合子在人脑中罕见，所以AD患者脑内的SNO-ApoE主要是nNOS催化ApoE3氨基酸序列112位点的半胱氨酸残基形成的，SNO-ApoE3可降低ApoE与低密度脂蛋白受体的结合而造成低密度脂蛋白受体丢失，从而增加患迟发型AD的风险。另外，ApoE除了脂质代谢与神经系统联系外，还可直接促进神经突起的延伸，这在重建受损神经纤维中起到重要作用，当ApoE发生巯基亚硝基化后，可能会影响其重建功能。这些提示SNO-ApoE可能在AD的病理机制中起到重要作用。

1.3 细胞周期依赖蛋白激酶巯基亚硝基化与AD 细胞周期依赖蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk)是主要参与肿瘤细胞增殖和死亡的蛋白激酶家族，但Cdk5与其它家族成员不同，它在神经系统中大量表达。目前认为，Cdk5的活性对于正常脑功能和神经退行性疾病的发病机制都具有重要作用，Cdk5的过度兴奋可使其具有神经毒性而损伤神经元。Qu等［10］研究发现，Cdk5氨基酸序列83和157位点的半胱氨酸残基是其发生SNO的位置。此外，他们还观察到尸检AD患者脑内的SNO-Cdk5水平明显升高，但正常人的脑组织中却没有这种现象。进一步研究发现，SNO-Cdk5的形成会增强Aβ毒性，致使树突棘损伤甚至缺失。因此，Cdk5的巯基亚硝基化通过使其活性增加而使Cdk5具备神经毒性作用，提示这种异常的酶活性调节机制可能参与了AD的病理过程。

1.4 10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因巯基亚硝基化与AD 10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是新发现的一种抑癌基因，它支配磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路，在几乎所有神经元中都表达，对中枢神经系统的多种功能都有至关重要的作用。已经发现AD患者的脑组织中p-Akt升高而PTEN减少。Kwak等［11］研究发现，PTEN氨基酸序列的83位点半胱氨酸残基是SNO的主要位置，并首次发现NO介导的PTEN的巯基亚硝基化可导致一系列翻译后修饰，而调节PTEN的降解。PTEN的下调会导致tau蛋白的过度磷酸化和聚集，表明SNO-PTEN可以间接促进AD的病理过程。

1.5 热休克蛋白90巯基亚硝基化与AD 热休克蛋白90(heat shock protein90，Hsp90)作为分子伴侣对细胞中众多信号蛋白的构象成熟和功能稳定进行调控。以往研究发现，Hsp90的水平升高可以维持tau蛋白与Aβ处于溶解状态而防止它们的聚集。最近 Martínez-Ruiz等［12］研究发现，内皮细胞中的Hsp90可以被巯基亚硝基化，其氨基酸序列597位点的半胱氨酸残基是发生SNO的位置，SNO-Hsp90抑制了它的ATP酶活性，取消了Hsp90作为分子伴侣的调控作用。因此，SNO-Hsp90可能会导致tau蛋白与Aβ的聚集而促使AD的发病。

目前对于AD发病有很多假说，越来越多的证据表明，一些AD相关重要蛋白质的巯基亚硝基化参与AD的发生、发展，所以蛋白质巯基亚硝基化可能是导致AD患者神经元损伤的重要原因，但其具体机制尚不完全清楚，有待进一步明确。

2 蛋白质巯基亚硝基化与PD

PD是另一种发病率较高的的慢性进展性神经退行性疾病，其主要的病理特征是黑质纹状体的多巴胺能神经元发生退行性病变，尸检可见PD患者、PD动物模型脑组织中存在路易小体(Lewy body)，残存的神经元中出现较多的α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集［13］。硝化应激通过使蛋白质巯基亚硝基化的方式参与PD病理发展过程已经成为一个重要的假说。

2.1 甘油醛-3-磷酸脱氢酶巯基亚硝基化与PD 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是一种糖酵解途径中的酶，在细胞死亡中发挥重要作用;Siah1是一个以多种核蛋白、胞质蛋白及膜蛋白为底物的E3泛素连接酶。Hara等［14］研究发现，GAPDH氨基酸序列150位点的半胱氨酸残基是发生SNO的位置，SNO-GAPDH的形成抑制其脱氢酶活性和抑制诱导酰基磷酸酶的活性，进而引发与E3泛素连接酶Siahl的相互作用，形成GAPDH-Siah1复合体，利于与SNO-GAPDH易位入核，并在Siah1定位下造成泛素化介导的核靶蛋白降解，最终导致细胞死亡。在Hara等［15］另一项研究中发现，经MPTP处理的小鼠脑组织中SNO-GAPDH明显增加，地普雷尼尔(丙炔苯丙胺)可以对抗MPTP诱导的毒性，同时减少纹状体内多巴胺能神经元的SNO-GAPDH增加，其机制可能是通过阻止GAPDH与Siah结合，而使SNO-GAPDH不能发生核易位，进而阻止细胞死亡。由此可见，SNO-GAPDH直接参与PD发生、发展的病理过程，可以是调控PD治疗的一个潜在靶点。

2.2 parkin蛋白巯基亚硝基化与PD parkin蛋白是一种E3泛素连接酶，在维持多巴胺能神经元正常功能中发挥重要作用。它可催化特定的底物与泛素结合，即蛋白泛素化，这一过程有助于细胞移除和恢复异常折叠或破坏的蛋白质。Chung等［16］研究发现，parkin蛋白氨基酸序列241和260位点半胱氨酸残基是其发生SNO的位置，SNO-parkin失去其E3泛素连接酶的活性。另外，在缺乏线粒体复合物Ⅰ的动物模型与散发性PD及弥漫性路易小体病患者的脑组织中均出现SNO-parkin，这说明parkin发生巯基亚硝基化，破坏了其泛素化异常蛋白及修复受损蛋白的功能，最终导致神经细胞死亡。SNO-parkin可能是导致PD发生的重要因素。

2.3 过氧化氧化还原蛋白巯基亚硝基化与PD 过氧化氧化还原蛋白(peroxiredoxin，Prx)是一个利用硫氧还蛋白系统清除胞内过氧化物的过氧化物酶类大家族，其家族成员Prx2在神经元中大量存在。Prx2可以将H2O2转化为H2O和O2。Fang等［17］研究发现，Prx2氨基酸序列51和172位点的半胱氨酸残基是发生SNO的位置，SNO-Prx2的形成抑制了Prx2对H2O2的清除作用，说明Prx2的巯基亚硝基化损害了它的抗氧化功能。暴露于鱼藤酮和MPP+的PD细胞模型会导致SNO-Prx2的产生，加入NO抑制剂后，Prx2的巯基亚硝基化明显降低。另外，在形成路易小体的PD患者脑组织中发现SNO-Prx2明显增加，而在AD患者和正常人的脑组织中却没有出现。这些研究均提示，SNO-Prx2使其对神经元的保护作用受到损伤，进而参与PD的病变过程。

2.4 X-连锁凋亡抑制蛋白巯基亚硝基化与PD X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是凋亡抑制蛋白IAPs家族的重要成员，具有抑制细胞凋亡作用。它有两个特征性的结构域:一个是BIR结构域，具有抗caspase的活性;另一个是Ring finger(环指结构域)，具有E3泛素连接酶的作用。由于这两个结构域含有多个半胱氨酸残基，有可能成为巯基亚硝基化的潜在靶点。Nakamura等［18］研究发现，硝化应激的条件下，XIAP的 BIR2-3，RING片段被巯基亚硝基化，其抗凋亡功能和E3泛素连接酶功能受到抑制，使caspase激活从而促进神经元死亡，进一步研究发现，XIAP氨基酸序列450位点的半胱氨酸残基是发生SNO的位置。然而 Tsang等［19］研究认为，NO主要修饰了BIR结构域的半胱氨酸残基，其抗凋亡作用受到抑制，但并未影响其作为E3泛素连接酶的活性。虽然对SNO发生的位置存在不同观点，但是已经发现PD患者和MPTP所致PD动物模型脑组织中，SNO-XIAP水平明显升高，这说明SNOXIAP可能对PD的病理过程起到促进作用。

PD是一种发病机制不清楚的神经退行性疾病，目前的研究表明，许多蛋白质的表达或活性异常与PD的发病相关，而这些蛋白质中一部分会通过发生巯基亚硝基化诱导神经元损伤或凋亡，从而直接或间接导致PD的发生;不过也有一些蛋白质不会发生巯基亚硝基化，因其不具有半胱氨酸残基结构，例如α-突触核蛋白。蛋白质巯基亚硝基化参与PD的具体机制尚不十分清楚，这将成为研究PD发病机制及蛋白质巯基亚硝基化的有趣课题，有待深入。

3 蛋白质巯基亚硝基化与其它神经退行性疾病

ALS是一种危及生命，病理过程发展迅速的神经退行性疾病，主要影响运动神经元。超氧化物歧化酶(SOD1)突变体对运动神经元具有毒性，可诱导内质网应激，其在散发性ALS中常见。

蛋白质二硫键异构酶(protein disulphide isomerase，PDI)主要在内质网中起到催化新生肽链的氧化折叠的作用。Walker等［20］研究发现，PDI的高表达可以降低SOD1突变体诱导的细胞死亡和减少SOD1突变体的聚集，同时抑制内质网应激。同时他们检测了散发性ALS患者腰脊髓，发现了SNO-PDI的存在，虽然PDI表达增多，但SNO-PDI占了总PDI很大一部分比例，而PDI发生巯基亚硝基化使其失去了对抗SOD1突变体聚集及其诱导细胞死亡的作用，不能有效抑制内质网应激，从而加重ALS的发病。同样的结果在SOD1G93A转基因小鼠脊髓中也被观察到。提示PDI发生巯基亚硝基化对ALS发病具有重要作用，可能是导致病变的机制之一，可以以此为切入点深入研究。

HD是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，主要是基底神经节严重病变，表现为慢性不自觉的手舞足蹈。亨廷顿基因(Htt)的表达和线粒体功能障碍可能与HD的病理机制有关，突变型Htt直接损害线粒体膜电位、钙稳态以及轴突传输功能。

如前叙述，Drp1是一个可以调解线粒体分裂的重要蛋白质，Drp1发生巯基亚硝基化后，会促进线粒体的分裂，已经观察到SNO-Drp1出现在HD患者体内，Wang等［21］研究发现，突变型Htt通过抑制线粒体复合物融合来增加氧化应激诱导的线粒体分裂和降低ATP水平。同时，Liot等［22］研究发现，融合蛋白Mfn2可降低突变型Htt诱导线粒体分裂以及ATP的损失和细胞死亡，这证明线粒体功能障碍对HD发病非常重要。SNO-Drp1形成后会加剧线粒体的过度分裂，提示可能是在突变型Htt和SNO-Drp1的多重作用下，线粒体严重受损而导致HD的发病。另外，GAPDH及PDI的巯基亚硝基化也与HD的发病机制密切相关，其分子机制可能与前述GAPDH及PDI参与PD或ALS的发病机制有相似之处。

4 展望

综上所述，自从发现NO可以介导蛋白质巯基亚硝基化修饰这一新的信号转导途径以来，其在细胞信号转导调控中的作用逐渐为人们所重视。虽然蛋白质巯基亚硝基化的反应机制、调控机制及特异性还不清楚，但越来越多的证据表明，诸如 GAPDH、parkin、PDI、XIAP等特殊靶蛋白的巯基亚硝基化已经成为神经退行性疾病发生、发展的重要参与者，因此，对于蛋白质巯基亚硝基化修饰的研究，将有助于确定治疗神经退行性疾病的新靶点，并为人们防治此类疾病提供新途径，新思路。

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