芍药苷通过调节前列腺素E2受体抑制大鼠成纤维滑膜细胞增殖

汪庆童，马昱琨，黄 蓓，魏 伟

(安徽医科大学临床药理研究所，抗炎免疫药理学省部共建教育部重点实验室，安徽合肥 230032)

滑膜炎是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)这一自身免疫性关节疾病的特征性病理表现，其中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)异常增殖活化［1－2］。前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)通过受体 EP(E-prostanoid)2和 EP4介导兴奋性G蛋白(stimulatory G protein，Gs)信号通路调节细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平和DNA合成而发挥致炎作用，是滑膜细胞活化导致滑膜炎的重要病理机制之一［3－4］。课题组研究发现，临床使用的天然药物白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)，其活性单体为芍药苷(paeoniflorin，Pae)，可以降低胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜细胞中抑制性G蛋白(inhibitory G protein，Gi)的表达，恢复cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活性［5］。本研究在以往工作的基础上，从调节EP2受体及信号通路的角度，观察Pae抑制PGE2诱导的大鼠FLS异常增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(120±20)g，♂，由安徽医科大学动物实验中心提供，合格证号:皖医实动准字第01号。

1.2 主要试剂 Pae，白色粉末，由安徽医科大学临床药理研究所化学室提供，高效液相法测纯度＞95%(LC-10AD高效液相色谱仪，日本);氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)购于中国科学院上海应用物理研究所;兔抗大鼠β-arrestin 2和EP2一抗，小鼠抗大鼠β-actin一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG抗体和免抗鼠IgG抗体均购于Santa Cruz公司;cAMP放免检测试剂盒为北京华英生物技术研究所产品。

1.3 FLS的分离培养 大鼠处死后，置于0.1%新洁尔灭液中浸泡15 min，于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织。用手术刀分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织。去除脂肪、纤维等，用D-Hank's液(无 Ca2+、Mg2+，含青霉素200 kU·L－1、链霉素 200 mg·L－1)反复冲洗后剪成 1 ～2 mm3小块，用玻璃吸管吸取均匀排列于培养瓶(预先用含20%胎牛血清DMEM培养液湿润)的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培养箱中培养6 h，使其贴壁。再轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔2～3天换一次培养液，观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养，待细胞快长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养，取第3～5代细胞用于实验。

1.4 FLS增殖反应 将培养得到的FLS分为正常组、PGE2125 μg·L－1刺激组及 PGE2刺激 +Pae 1、10、100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1给药组，作用 24 h。采用3H-TdR参入法，终止培养前6 h每孔加入20 μl3H-TdR，培养结束后收集细胞，用液闪仪(LS6500液体闪烁计数仪，Beckman公司)测其放射性，结果以3个复孔cpm的均值表示。

1.5 FLS内cAMP浓度检测 取第3代FLS，每孔1×109cells·L－1接种于24孔板，给药后培养24 h，PBS洗涤细胞1次，每孔加50 mmol·L－1醋酸缓冲液1 ml终止反应，用枪头将孔底细胞刮下，移入1.5 ml eppendorf管，细胞超声破碎，4℃ 1 200×g离心5 min，取上清液，－20℃保存，按照125I cAMP放免试剂盒说明书进行，使用γ-911全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司生产)测定。

1.6 流式细胞术检测FLS细胞表面EP2的表达细胞给药处理后，PBS洗涤细胞1次，0.25%胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤1次后用4%多聚甲醛室温固定 40 min，2 000 r·min－1离心 10 min，去上清后，用含0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS重悬细胞，加入兔源性抗EP2受体一抗(1∶50)，37℃孵育30 min，离心去上清重悬沉淀，加FITC标记的羊抗兔二抗(1∶200)37℃避光孵育20 min，网纱过滤后用流式细胞仪(Beckman FC500)检测。

1.7 Western blot法检测 β-arrestin 2胞膜和总表达以及EP2的总表达 取第3代FLS，每孔1×109cells·L－1接种于6孔板，各组给药后培养24 h，加入RIPA裂解液后超声降解，提取总蛋白，100 000 r·min－1离心1 h，沉淀物为胞膜蛋白，用裂解液溶解，加入上样缓冲液煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳(5%的浓缩胶和10%的分离胶)，转膜，5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h，加抗β-arrestin 2或EP2(1∶1 000)抗体，内参用β-actin单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1∶30 000)37℃孵育2 h，ECL法显影，分析条带灰度值。实验重复3次，以目的条带与β-actin条带的灰度比值来表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 Pae抑制PGE2诱导的大鼠FLS异常增殖对不同浓度 PGE2(1、5、25、125、615 μg·L－1)作用不同时间(12、24、36、48、60 h)诱导 FLS 的增殖预实验结果提示，PGE2125 μg·L－1为刺激的亚适浓度，24 h为最适时间，这一条件用于本实验。第3代大鼠 FLS 体外用 PGE2125 μg·L－1刺激，同时加入不同浓度的 Pae，培养24 h，3H-TdR参入法检测 FLS的增殖能力。从Fig 1中可以看出，PGE2明显促进FLS 的增殖(P＜0.01)，Pae 10、100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1不同程度抑制FLS的增殖。

Fig 1 Effect of Pae on proliferation of PGE2-induced rat FLS(±s，n=5)

2.2 Pae恢复PGE2降低的FLS内cAMP浓度用放免法检测各

组FLS内cAMP水平，如Fig 2所示，PGE2作用24 h后降低了细胞内的cAMP浓度，Pae体外给药可以逐步升高cAMP浓度，其中Pae 100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1对 cAMP 水平有明显影响(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 Pae对细胞膜EP2受体表达的影响 采用流式细胞术检测不同浓度Pae对PGE2作用下FLS细胞膜EP2受体表达情况(Fig 3A～E)，去除非特异性染色后，比较X轴平均荧光强度的变化(Fig 3F)。统计发现，正常大鼠FLS细胞膜上EP2受体的平均荧光强度为23.33±4.54，PGE2作用24 h后，EP2胞膜表达降低(15.23±1.30，与正常组比较P＜0.01)，Pae不同浓度体外给药升高EP2的胞膜表达(Pae 1 μmol·L－1为 19.73 ± 1.70，Pae 10 μmol·L－1为20.20 ±2.23)。

Fig 2 Effect of Pae on cAMP concerntration in PGE2-induced rat FLS(±s，n=5)

Fig 3 Effect of Pae on membrane EP2 expression in rat FLS treated by PGE2( ± s，n=4)

2.4 Pae对PGE2诱导的大鼠FLS总β-arrestin 2和EP2以及胞膜β-arrestin 2表达的影响 大鼠FLS裂解后经超速离心，分离出胞膜蛋白，Western blot法检测细胞胞膜和总蛋白的表达情况，结果显示PGE2作用下，FLS总β-arrestin 2、EP2以及胞膜β-arrestin 2 表达均升高，Pae 1、10 μmol·L－1可明显降低细胞总EP2和β-arrestin 2的表达，Pae 3个浓度可不同程度抑制胞膜β-arrestin 2表达。

Fig 4 Effect of Pae on membrane β-arrestin 2，total EP2 and β-arrestin 2 expression in rat FLS treated by PGE2(±s，n=3)

3 讨论

滑膜炎中FLS异常增殖活化，随之形成血管翳，逐渐向关节面和关节软骨扩散、侵蚀，并最终破坏关节软骨和软骨下骨，使关节畸形而失去功能［6］。多种信号转导参与了FLS的异常增殖，研究发现，作为最大受体超家族的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)介导的信号通路在RA FLS过度增殖中发挥了重要的作用。关节炎动物模型的FLS存在G蛋白的含量变化和功能障碍，cAMP水平和PKA活性降低［7］。EP2和EP4是表达于滑膜细胞膜上的重要GPCRs，均与Gs蛋白偶联［4］。本课题组研究发现，佐剂性关节炎(adjuvantinduced arthritis，AA)大鼠FLS的EP2受体表达升高［7］，但为何细胞内cAMP水平和PKA活性反而降低?本实验发现PGE2诱导的大鼠FLS总EP2蛋白表达升高，与前期研究一致，但细胞膜EP2受体表达水平低于正常细胞，导致对Gs信号激活减弱，cAMP产生减少。

活化的FLS细胞膜EP2受体为何减少?我们检测了GPCRs重要的负调节因子之一β-arrestin 2。β-arrestin与GPCRs激酶(G-protein-coupled receptor kinases，GRKs)联合作用，通过介导受体脱敏和内吞，对大部分GPCRs信号转导通路具有重要的负调节作用［8］。当GPCRs被激活后，β-arrestin转移到细胞膜，结合到被激动剂占领的受体上，促使这些受体与G蛋白分离，从而导致受体脱敏。活化的β-arrestin分子释放出C末端，与胞内小泡表面的网格蛋白(clathrin)结合，介导 GPCRs的内吞。β-arrestin可以调节内吞后GPCRs的运输模式，在GPCRs循环中起到了特别的作用［9］。β-arrestin有 β-arrestin 1和2两个亚型，广泛的存在于各种细胞中。β-arrestin 1还可以进入细胞核内直接或间接影响一些转录因子，在基因表达调控上发挥更多的功能，βarrestin 2主要介导受体的调节和信号转导［10］。CIA大鼠滑膜细胞β-arrestin 1，2表达的增高与病程一致，在关节炎症高峰期表达最高，TGP体内给药抑制FLS中 β-arrestin 1，2 的表达水平［11］。本实验进一步发现活化的FLS总β-arrestin 2和胞膜β-arrestin 2表达均升高，提示在PGE2刺激下，由于β-arrestin 2产生和募集到胞膜上的量增多，介导了EP2受体的内吞，从而降低了Gs下游信号分子cAMP的水平，引起FLS异常增殖。

目前RA的治疗效果仍不尽人意，天然药物因疗效肯定，不良反应少显示出了广阔的应用前景。白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)已经作为一个抗炎免疫调节药被正式批准生产上市，用于治疗RA等疾病。前期研究发现，TGP的主要有效成分Pae可以升高cAMP水平和PKA活性，改善滑膜细胞功能［12－13］。本实验观察到Pae通过减少细胞膜β-arrestin 2的富集，升高细胞膜EP2受体水平，改善Gs信号通路，从而提高FLS内cAMP水平，抑制PGE2刺激下FLS的过度增殖，这一分子机制可能部分解释Pae发挥作用的分子机制。然而，Pae如何影响到细胞内的β-arrestin 2，进而发挥调节细胞表面GPCRs数量和活性的作用，仍需进一步阐明。

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