高效液相色谱法和非水电位滴定法测定注射用盐酸赖氨酸含量的比较

2012-07-28李健和彭词艳曾小慧易利丹

中国药业 2012年15期

成丹，李健和，彭词艳，曾小慧，3，易利丹

(1.湖南省湘乡市人民医院药剂科，湖南湘乡 411400;2.中南大学湘雅二医院药学部，湖南长沙 410011; 3.中南大学药学院，湖南长沙 410013)

赖氨酸是人体8种必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用[1－2]。目前开发上市的注射制剂有盐酸赖氨酸注射液、注射用盐酸赖氨酸、盐酸赖氨酸氯化钠注射液、盐酸赖氨酸葡萄糖注射液[3－7]，临床上用于治疗颅脑外伤、慢性脑组织缺血、缺氧性疾病的脑保护剂[8－10]。鉴于盐酸赖氨酸本身无紫外吸收，亦不产生荧光，且注射用盐酸赖氨酸系主药盐酸赖氨酸以注射用水加热溶解并经针用活性炭脱色后直接冻干而成的制剂，制剂中无其他任何辅料。为此，参照2010年版《中国药典(二部)》盐酸赖氨酸原料药建立了非水电位滴定法测定注射用盐酸赖氨酸含量，并与柱前衍生化高效液相色谱法进行比较，现报道如下。

1 仪器与试药

LC－10Avp型高效液相色谱仪(日本岛津);SPD－10Avp型紫外检测器;分析之星色谱工作站;FA1004N型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)。盐酸赖氨酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为160732－201008，含量为99.6%);盐酸赖氨酸原料药(晋州冀荣氨基酸有限公司，批号为20101005，含量为99.2%);注射用盐酸赖氨酸(由中南大学湘雅二医院药学部提供，规格为 1.5 g/瓶，批号为 20110214，20110215，20110216);2，4－二硝基氟苯为衍生化试剂，甲醇、乙醇均为色谱纯，水为重蒸馏水，碳酸氢钠、醋酸钠、冰醋酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 非水电位滴定法

2.1.1 测定方法确定

由于注射用盐酸赖氨酸处方中未加任何辅料，故参考2010年版《中国药典(二部)》盐酸赖氨酸的含量测定方法，拟订本品的测定方法为高氯酸滴定法。取装量差异项下内容物约80 mg，精密称定，加醋酸汞试液5 mL，振摇使溶解，加冰醋酸25 mL，照电位滴定法[2010年《中国药典(二部)》附录ⅦA]，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL高氯酸滴定液(0.1 mol/L)相当于 9.133 mg 的 C6H14N2O2·HCl。

2.1.2 方法学考察

空白干扰试验:不加盐酸赖氨酸，采用上述方法滴定，结果消耗高氯酸滴定液(0.1052 mol/L)0.02 mL。

精密度试验:取盐酸赖氨酸对照品约80 mg，共6份，精密称定，按上述方法测定。结果平均含量为99.5%，RSD为0.33%。

回收率试验:取盐酸赖氨酸约64，80，96 mg，各3份，精密称定，用上述方法滴定。结果见表1。

表1 非水电位滴定法测定盐酸赖氨酸的回收率试验结果(n=9)

重复性试验:取同一批样品，称取6份装量差异项下内容物约80 mg，精密称定，用上述方法滴定。结果平均含量为99.7%，RSD为0.35%，表明方法重复性良好。

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 色谱条件

色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Phenomenex C18柱(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流动相:甲醇－0.05 mol/L 醋酸钠和醋酸溶液(60 ∶40);流速:1.0 mL/min;检测波长:360 nm，柱温:40℃;进样量:20 μL。理论板数按盐酸赖氨酸峰计算应不低于1000。

2.2.2 溶液制备

称取盐酸赖氨酸对照品约15 mg，精密称定，置250 mL容量瓶中，加蒸馏水适量，振摇使溶解，加蒸馏水稀释至刻度，然后精密吸取5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，加1%2，4－二硝基氟苯乙腈溶液2.5 mL和5%碳酸钠溶液2.5 mL，摇匀，于80℃水浴反应20 min，放冷，加pH为7.0的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。称取注射用盐酸赖氨酸约15 mg，精密称定，置250 mL量瓶中，加蒸馏水适量，振摇使溶解，加蒸馏水稀释至刻度，然后精密吸取5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，按对照品溶液的制备法制备供试品溶液。精密吸取蒸馏水5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，按对照品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

空白干扰试验:分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图相同保留时间有相应的峰，阴性对照品溶液无对应峰，无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别称取盐酸赖氨酸对照品约5，10，15，20，25 mg，精密称定，依法制备对照品溶液，分别量取20 μL，注入液相色谱仪，以质量浓度 C对主峰面积 A进行线性回归，得回归方程 A=24135 C－13191，r=0.9995。结果表明，盐酸赖氨酸质量浓度在2.0～10.0 μg/mL的范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取线性关系考察项下质量浓度为6.0 μg/mL的对照品溶液，精密量取20 μL连续进样6次。结果主峰面积的平均值为131764，RSD为0.41%。

重复性试验:取批号为20110215的样品5份，各精密称取15 mg，依法制备供试品溶液并测定，以外标法计算其标示百分含量。结果平均含量为100.9%，RSD为0.35%。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在 0，2，4，6，8，12 h 时取样测定。结果主峰面积的平均值为131807，RSD为0.48%，表明供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定。

加样回收试验:取盐酸赖氨酸约12，15，18 mg各3份，精密称定，按含量测定方法进行测定，结果见表2。

表2 衍生化高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸的回收率试验结果

2.3 样品含量测定

分别采用非水滴定法和高效液相色谱法测定3批样品的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果(标示量的%)

3 讨论

文献报道盐酸赖氨酸的含量测定方法有电位滴定法[11－12]、柱前衍生化高效液相色谱法[13－15]、阳离子交换色谱高效液相色谱法[6]、蒸发光散射检测高效液相色谱法[7]、与茚三酮反应显色后可见分光光度法[16]等。蒸发光散射检测高效液相色谱法往往受设备条件限制，与茚三酮反应显色后可见分光光度法误差较大，故在参考上述相关文献的基础上，本试验分别采用非水电位滴定法和柱前衍生化高效液相色谱法进行注射用盐酸赖氨酸的含量测定，并对两种方法测得的3批样品含量进行比较，结果表明，两者都可准确地用于本品的含量测定，测得3批样品的含量基本一致，均可为该药物的质量控制提供保证。但两种方法各有优缺点，柱前衍生化高效液相色谱法专属性强、灵敏度高、重复性好，但操作繁杂，衍生化反应所需试剂难得;非水电位滴定法测定其电位突跃明显、易辨、精密度和重复性良好、操作简便、成本低、结果准确，能够满足其质量控制，更适合于常规检测。因此，采用非水电位滴定法测定本品含量。根据本品所用的测定方法及试验测定结果，结合生产实际，并参照2010年版《中国药典(二部)》对注射剂的一般规定要求，拟订本品含量限度，含盐酸赖氨酸(C6H14N2O2·HCl)应为标示量的 95.0% ～ 105.0%。

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