反相高效液相色谱法测定心可舒颗粒中葛根素和芦丁含量

阳 华，王文渊，蒋小玲

(1.湖南省永州市药品检验所，湖南 永州 425600; 2.湖南永州职业技术学院，湖南 永州 425600;3.湖南恒伟药业有限公司，湖南 永州 425000)

心可舒颗粒是以山楂、丹参、葛根、三七、木香5味中药为原料制成的颗粒制剂，具有活血化瘀、行气止痛的功效，用于气滞血瘀型冠状动脉粥样硬化性心脏病引起的胸闷、心绞痛、高血压、头晕、头痛、颈项疼痛及心律失常、高血脂等症的治疗。山楂、丹参为方中主药，其所含黄酮成分同样具有扩张血管、增加血流量[1－2]、降低心肌耗氧量、降低血清胆固醇、抗动脉硬化、抗心绞痛作用[3－5]，具有防治心血管疾病的功能[6]，测定方法使用可见－紫外分光光度法。但现行使用的心可舒颗粒质量标准仅以测定葛根素的含量来控制质量[7]，而未对其他两味君药进行质量评价。笔者采用反相高效液相色谱法同时测定葛根素和芦丁的含量，以芦丁为对照计算总黄酮[8－9]，可控制产品中山楂、丹参、葛根3味主药材的质量，进一步完善和提高了该制剂的质量标准。

1 仪器与试药

Waters 600E泵高效液相色谱仪，Waters PAD996二极管阵列检测器;Waters M32色谱工作站;Mettler AE240型天平(梅特勒－托利多上海仪器有限公司);KS－600D型超声清洗器(宁波科生仪器厂)。葛根素对照品(批号为110736－200527)、芦丁对照品(批号为07773－9910)均购自中国药品生物制品检定所;心可舒颗粒(湖南恒伟药业有限公司，批号分别为090813，091101，091008);甲醇、乙腈为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Symmetry C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:0.8 mL/min;检测波长:252 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;流动相:甲醇－水－乙腈－冰醋酸(28∶60∶10∶2)。在上述色谱条件下，葛根素和芦丁的理论板数分别大于5000和4000，葛根素和芦丁与其相邻峰分离良好，谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的葛根素对照品12.7 mg，芦丁对照品 9.85 mg，置 50 mL 量瓶中，用 70% 甲醇溶解定容至刻度，制成含葛根素0.254 g/L、芦丁0.197 g/L的混合对照品溶液。取装量差异项下的样品，研细，精密称取0.5 g，置具塞三角瓶中，加70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)40 min，取出，放冷至室温，再次称定，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密取续滤液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按处方比例称取除山楂、丹参的其他药味，依照心可舒颗粒的制备工艺制成缺山楂、丹参的心可舒阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密量取混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 50 mL 棕色量瓶中，用 70% 甲醇释至刻度，摇匀，制成葛根素和芦丁的系列混合标准溶液。分别精密吸取上述溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积 Y为纵坐标、质量浓度 X为横坐标绘制标准曲线。葛根素的回归方程为 Y=4837.174X+157.92，r=0.9998(n=6)，表明葛根素质量浓度在2.54～25.4 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好;芦丁的回归方程为 Y=3228.516X －71.86，r=0.9996(n=6)，表明芦丁质量浓度在1.97～19.7 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定色谱峰面积。结果葛根素、芦丁峰面积积分值的 RSD分别为1.85%和2.04%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，照2.1项下色谱条件分别于配制后 0，2，4，6，8，10 h 时进样。结果葛根素、芦丁峰面积积分值的 RSD分别为1.29%和 1.54%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

重复性试验:取6份同一批(批号为091004)样品粉末0.5 g，精密称定，按2.2项下方法制成6份供试品溶液，按2.4项下操作。结果葛根素和芦丁含量的平均值分别为16.57 mg/g和5.74 mg/g，RSD 分别为 1.17%和 1.69%(n=6)。

加样回收试验:精密称取已知含量的本品3组，每组2份，3组分别精密加入一定量的葛根素和芦丁对照品，按供试品溶液制备方法制备及色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取不同批次的样品，按供试品溶液制备方法制备所需供试品溶液;精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积，用外标法计算样品中葛根素、芦丁的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

在采用超声提取有效成分时，考察了不同提取时间(20，30，40，50 min)对测定结果的影响。结果表明，超声40 min已能将样品中的有效成分提取完全，因此选择超声提取40 min。若以流动相为稀释剂，色谱显示主成分峰与杂质峰不能完全分离，影响定量分析结果，故选用甲醇为稀释剂。

各取葛根素和芦丁对照品适量，初始流动相溶解配成溶液，在200～400 nm波长范围进行扫描，发现葛根素在195，252，305 nm处有吸收峰。芦丁在254，347 nm处有吸收峰，在252 nm处也有较强吸收，故选择252 nm作为检测波长。

在对流动相乙腈－水、甲醇－水、甲醇－水－乙睛、甲醇－水－乙睛－冰醋酸的组成及比例进行的反复试验比较中发现，以甲醇－水－乙睛－冰醋酸(28∶60∶10∶2)作流动相，分离效果较好，得到色谱图的峰形较好。所建立的方法重现性好，测定结果准确，为产品的质量控制提供了新的依据。

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