高效液相色谱法测定兔血浆中盐酸氯胺酮质量浓度＊

曹殿青 ，赵丽斌，吕应年，鲁应军，田 乐

(1.广东医学院附属医院麻醉科，广东 湛江 524000; 2.广东医学院研究生院，广东 湛江 524023;3.广东医学院天然药物开发研究中心，广东 湛江 524023)

氯胺酮为苯环己哌啶的衍生物，系一种新型的分离麻醉药，起效快，作用时间短，是目前唯一具有镇痛作用的静脉全身麻醉药，因其作用确切、呼吸影响小、咽喉保护性反射抑制轻微等优点，广泛用于小儿麻醉和辅助麻醉，但不良反应较多，因此需明确了解其在体内的血药浓度，保证术中患者生命体征的平稳。笔者在参考文献[1]的基础上，建立了具有操作简便、快速准确、经济实用的检测血浆中盐酸氯胺酮质量浓度的方法，为盐酸氯胺酮临床血药浓度的监测及毒理学和药动学的研究提供帮助。

1 仪器与试药

美国安捷伦1200型高效液相色谱仪，包括G1311A四元梯度泵及G1322AA在线脱气机、1515B二极管阵列检测器;HP1200色谱工作站;TDL－40B离心机(上海安亭科学仪器厂);AE240型电子天平(梅特勒－托利多上海有限公司);漩涡混合器。盐酸氯胺酮标准品、布比卡因标准品由上海瑞齐有限公司提供;乙腈、甲醇为色谱纯(天津四友公司)，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇－乙腈－磷酸盐缓冲液(50∶15∶35)，流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长220 nm，进样量20 μL。

2.2 标准溶液制备

精密称取盐酸氯胺酮、布比卡因标准品适量，分别用甲醇定容后配成两种标准贮备液，质量浓度分别为1 g/L和100 μg/mL的贮备液，于4℃冰箱内保存备用，用前配制成不同质量浓度的标准溶液。

2.3 血样处理

取新鲜全血2 mL，迅速加入含50IU肝素的试管中，4000 r/min离心10 min，精密吸取兔血浆1.0 mL至5 mL具塞玻璃试管，置冰箱备用。精密吸取0.2 mL含药血浆至5 mL玻璃试管，加入内标液(100 μg/mL 布比卡因 50 μL)，2 mol/L NaOH 10 μL，涡旋30 s，再加入2mL乙酸乙酯萃取，涡旋30s，在振荡器上振摇20 min，12000 r/min离心10 min，取有机相移入至另一洁净管内，氮气吹干，加入流动相200 μL溶解，高效液相色谱仪中进样20 μL分析，重复3次。

2.4 方法学考察

专属性考察:取空白血浆、空白血浆+布比卡因、空白血浆+盐酸氯胺酮、空白血浆+盐酸氯胺酮+布比卡因，按照2.3项下方法测定，所得色谱图见图1。盐酸氯胺酮和布比卡因的保留时间分别为5.018 min和8.161 min，血浆内源性物质不影响盐酸氯胺酮的测定。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:于空白兔血浆中加入不同质量浓度的盐酸氯胺酮标准溶液，使其血浆浓度分别为 0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，25 μg/mL，按照2.3项下方法进行测定。由色谱图计算样品峰面积 A样和内标峰面积 a标的比值 Y(Y=A样/a标)，以 Y对血药浓度 C(μg/mL)、用加权最小二乘法作回归计算，得标准曲线方程 Y=0.0421 C+0.012(R2=0.9995)。结果表明，盐酸氯胺酮质量浓度在0.25～25 μg/mL范围内与峰面积比呈良好的线性关系，以信噪比值(S/N)不小于3确定的最低检测浓度为0.1 μg/mL。

精密度试验:于空白血浆中加入不同质量浓度的盐酸氯胺酮标准溶液，使其血浆浓度分别为 0.5，2.5，25 μg/mL，按照 2.3 项下方法进行测定。取3种质量浓度的供试液分别于第1日和第3日的 0:00，4:00，8:00，12:00，16:00，20:00 不同时间段测定 12次，记录每次测得的质量浓度，计算日内、日间精密度。结果0.50，2.50，25.00 μg/mL血浆浓度下日内、日间精密度 RSD 分别为3.46%，2.22%，3.53%和3.08%，4.90%，4.76%，表明仪器精密度良好。

回收率试验:取盐酸氯胺酮标准溶液，用甲醇配制成质量浓度分别为 0.5，2.5，25 μg/mL 的溶液，每种质量浓度各 0.2 mL，加入内标液50 μL，混匀，氮气吹干，加入流动相200 μL涡旋3 min，吸取20 μL经高效液相色谱分析测定，得盐酸氯胺酮峰面积 A1。于空白血浆中加入不同浓度的盐酸氯胺酮标准溶液，使其血浆浓度分别为 0.5，2.5，25 μg/mL，按照 2.3 项下方法测定，得盐酸氯胺酮峰面积 A2，根据方程计算盐酸氯胺酮的测定浓度(C测)。提取回收率=(7×A2)/(5×A1)×100%，方法回收率=C测/C标准×100%。结果见表1。

表1 盐酸氯胺酮回收率试验结果

稳定性试验:于空白血浆中加入盐酸氯胺酮标准溶液，配置成质量浓度为 2.5 μg/mL 的溶液，按照 2.3 项下方法，取 0，3，6，12，24，36，48 h不同时点进行测定，记录每次测得的质量浓度。结果的 RSD=4.46%(n=7)，表明溶液稳定性良好。

3 讨论

盐酸氯胺酮为白色结晶性粉末，无臭，在水中易溶，在热乙醇中溶解，在乙醚或苯中不溶[2]，熔点259～263℃，熔融同时分解。盐酸氯胺酮的化学名为2－(2－氯苯基)－2－(甲氨基)环己酮盐酸盐，分子式为C13H16ClNO·HCl。本试验根据其结构特点，先碱化血浆使其以分子形式存在，再用有机溶剂萃取，挥干后以醇重溶。

在萃取试验中，比较了碱化血浆与不碱化血浆的萃取率，并对碱化溶液的用量进行了考察。结果表明，用2 mol/L NaOH可使萃取率得到较大的提高。

在萃取溶剂的选择上，分别对乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、正己烷－异丙醇－二氯甲烷(64∶3∶33)5种萃取溶剂进行考察[3－5]，发现用二氯甲烷进行萃取时，由于萃取溶剂密度大，有机溶剂在血浆层下，操作时有机层不易被吸取出，影响盐酸氯胺酮的萃取率;正己烷、正己烷－异丙醇－二氯甲烷(64∶3∶33)萃取时杂质较多，且有机溶剂的配比不易精确，干扰样品的测定;用乙醚和乙酸乙酯萃取时其回收率高、杂质少，但乙醚的挥发性造成结果变动较大。最终确定乙酸乙酯为萃取液。

对多种流动相进行了筛选分析，用甲醇与水的一定比例或加少量酸或加少量碱时，存在分析时间过长、杂质峰干扰主峰等弊端;用 磷酸盐缓冲盐 (0.025 mol/L K2HPO4与 0.003 mol/L KH2PO4等量混合)－甲醇(35∶65)时[5]，峰形欠佳，存在拖尾现象;而用磷酸盐缓冲盐 (0.02 mol/L K2HPO4与0.02 mol/L KH2PO4以2.5∶1混合)－甲醇 －乙腈(50∶15∶35)时，杂质对测定无干扰，各组分的分离度和峰形都较好，且分离周期短。因此，采用最后一种方案作为本试验的流动相。

本试验所建立的高效液相色谱法操作简便、经济实用、方法可靠、专属性理想、稳定性好，适合临床用于进行盐酸氯胺酮的药动学研究。

[1]Aboul－Enein HY，Hefnawy MM.Liquid chromatographic high－throughput analysis of ketamine and its metabolites in human plasma using a monolithic silica column and solid phase extraction[J].Talanta，2005，65(1):67－73.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:787.

[3]金 岩，郑云华，陆艳清，等.高效液相色谱法测定兔血浆中盐酸氯胺酮含量[J].实用药物与临床，2009，12(3):197－199.

[4]张 丹，姜 焱.反相高效液相色谱法同时测定血浆中氯胺酮、苯巴比妥和阿托品的浓度[J].中国医院药学杂志，1997，17(3):101－103.

[5]邱 枫，肇丽梅，孙亚欣，等.高效液相色谱法同时测定血浆中的氯胺酮、咪唑西泮的浓度[J].中国医院药学杂志，2004，24(8):476－477.