低温脂肪酶产生菌Trichosporon pullulans的脂肪酶基因克隆

肖 冬

(陕西核工业二一一地质大队分析测试中心，陕西 西安 710024)

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是分解脂肪的酶，在动植物组织及微生物中普遍存在，自1834年兔胰脂肪酶的活性报道至今，有关脂肪酶的研究已有上百年的历史[1]，脂肪酶的自然底物是在水中微溶的长链三酰甘油酯[2]，催化反应发生在水与有机相的交接处，微粒状态下的脂肪酶能很好地催化酯化、醇化、酸化反应[3～12]。

脂肪酶产生菌主要来自系统分析树的两大分支：一个是原核细胞细菌，另一个是真核细胞，包括动物、植物、真菌以及古细菌[13]。工业用脂肪酶多来源于微生物，产脂肪酶的菌类主要有黑曲霉菌、荧光假单胞菌、白地霉无根根霉菌、毛霉圆柱假丝酵母菌、巢子须霉德氏根霉菌、多球菌绵毛状腐质霉菌、圆弧青霉粘质色杆菌等。

有关细菌脂肪酶的分子生物学，已测定了假单胞菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌等众多细菌脂肪酶的基因序列和对应的氨基酸序列[14，15]。

目前，脂肪酶已广泛应用于工业生产领域，每年约有1000 t脂肪酶应用于约130 亿t 去污剂的生产，而用于油脂化学转化中的脂肪酶相对少一些。脂肪酶可以用于多不饱和脂肪酸(γ-亚麻酸)、食物色素(虾青素)、典型蓝干酪的气味分子(甲基酮)和水果香料(4-羟基癸酸)的生产；还可用作甘油酯中的酯交换替代品(如生产巧克力中可可脂的替代品)；可通过脂肪酶修饰植物油中的三酰甘油制得婴儿食品中的人乳脂肪类似物；可用于化妆品的生产；可用作食品业和制药业中重要的乳化剂；可在药物的生产中合成单一异构体，如抗炎药物萘普生和异丁苯丙酸、血管紧张肽转化酶抑制子(如卡托普利、依那普利、赖诺普利)以及钙离子通道药物硫氮草酮等。随着酶学研究的快速发展，微生物脂肪酶的应用领域仍将不断扩展，可以预测，脂肪酶将成为重要的工业生产酶。

作者在此对低温脂肪酶产生菌Trichosporonpullulans的脂肪酶基因进行了克隆，并对PCR扩增条件进行了优化。

1 实验

1.1 菌株

菌株5-1(酵母Trichosporonpullulans茁芽丝孢酵母属)，将新鲜的0.5 mL菌液与0.5 mL 40%(体积分数)灭菌甘油充分混合后，置-80 ℃存放。

1.2 试剂与仪器

DNA回收试剂盒，TIANGEN BIOTECH；1 kb plus DNA Ladder﹑1 kb DNA Ladder、LA Taq酶、蛋白酶K，天为时代；dNTPs﹑Taq DNA 聚合酶、10×LA buffer、6×loading buffer，TakaRa；Tris碱，Novon；CTAB，amresco；其它试剂均为国产分析纯。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

立式高速冷冻离心机，长沙湘仪；台式高速冷冻离心机，江西日博工贸有限公司；PCR仪，Techne公司；制冰机，美国格兰特中国制冷设备制造有限公司；移液枪，上海之信仪器有限公司；超净台，苏州净化；灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；电泳仪，北京六一仪器制造厂。

1.3 培养基及培养条件

1.3.1 培养基

高氏Ⅰ号液体培养基：2%可溶性淀粉，0.1% KNO3，0.05% K2HPO4，0.05% NaCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.001% FeSO4·7H2O，pH值7.2～7.4。用去离子水配制，使用前于121 ℃高压灭菌20 min。

1.3.2 培养条件

30 ℃、130 r·min-1摇床培养2～3 d。

1.4 缓冲溶液

所有溶液均用超纯去离子水配制，使用前经过高压湿热灭菌或者溶液的成分单独灭菌。

(1)1×TE buffer：10 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)+10 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

(2)Tris-HCl：1 mol·L-1Tris用HCl调节至适当的pH值。

(3)Tris饱和苯酚：苯酚用100 mmol·L-1Tris-HCl(pH值5.0)饱和。

(4)苯酚-氯仿：饱和苯酚与氯仿以1∶1(体积比)混合。

(5)TAE：40 mmol·L-1Tris-醋酸+1 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

(6)10×TBE：900 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)+900 mmol·L-1Boric-acid+20 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

(7)溶菌酶混合液：2 mg·mL-1溶菌酶+50 μg·mL-1Rnase+0.3 mol·L-1蔗糖+25 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)+25 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

以20 mL为例：溶菌酶40.0 mg；Rnase 1 mg(10 mg·mL-1Rnase水溶液100 μL，1 mg·mL-1Rnase水溶液1 mL)；蔗糖0.006 mol，约2.054 g；50 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)10 mL，0.0606 g；0.5 mol·L-1EDTA 1.0 mL，0.1861 g。

(8)DNA提取液：100 mmol·L-1Tris-HCl+100 mmol·L-1EDTA+100 mmol·L-1Na2PO3+1.5 mol·L-1NaCl+1% CTAB，pH值8.0。

(9)3 mol·L-1NaAc：40.8 g NaAc·3H2O，加水40 mL溶解，加冰醋酸调pH值5.2，定容100 mL。

1.5 方法

1.5．1 模板DNA(基因组DNA)的提取

1.5.1.1 CTAB法[16]

(1)取培养1～2 d的菌液20 mL于10 000 r·min-1离心10 min，取50 mg菌泥加500 μL无菌水清洗，离心，取沉淀，加入100 μL TE反复冻融2～3次，在-80～-65 ℃冰箱中放置1 h以上，再高温(100 ℃)水浴1 min。

(2)离心(13 000 r·min-1,5 min)后取出TE，沉淀加135 μL DNA提取液，再加1 μL 10 mg·mL-1蛋白酶K于37 ℃水浴0.5 h(不时振荡)。

(3)加15 μL 20% SDS至终浓度为2%，于65 ℃水浴1.5 h(不时混匀)。

(4)离心(13 000 r·min-1，5 min)，取上清与上两步的TE合并。

(5)用等体积酚(可省略)、苯酚-氯仿(用前静置过夜)、氯仿依次抽提，混匀后静置，离心(13 000 r·min-1，5 min)，取上清。

(6)加0.6～1 BV的异丙醇常温沉淀1 h，然后离心(13 000 r·min-1，15 min)。

(7)沉淀用70%乙醇清洗，离心(7500 r·min-1，5 min)，取沉淀烘干后用30 μL无菌水溶解。

(8)DNA的纯化：取提取的DNA溶液10 μL，按溶菌酶中Rnase的浓度,加入0.1 μL 10 mg·mL-1Rnase,于37 ℃水浴30 min；加入1 μL(1/10)的NaAc(3 mol·L-1，pH值5.2)，再加入33 μL[(10+1)×3]无乙水醇；放入-20 ℃冰箱内冷藏20 min；离心(13 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，弃上清；用500 μL 70%乙醇洗涤沉淀，离心(13 000 r·min-1，5 min)，烘干，加10 μL无菌水溶解。

1.5.1.2 酶法

(1)取培养1～2 d的菌液20 mL于10 000 r·min-1离心10 min，取50 mg菌泥加500 μL无菌水清洗，离心，取沉淀，加入100 μL TE反复冻融2～3次，在-80～-65 ℃冰箱中放置1 h以上，再高温(100 ℃)水浴1 min，冻融后离心(13 000 r·min-1，5 min)，取沉淀。

(2)将沉淀重悬于500 μL溶菌酶混合液，37 ℃温育0.5～1 h，再补加酶液100 μL，于40～50 ℃继续保温30 min。

(3)菌液透明后，加20%SDS至终浓度为2%(500 μL +100 μL+65 μL=665 μL，65/665≈1/5)，搅拌约5 min至菌液粘度显著下降，离心(15 000～13 000 r·min-1，5～10 min)，取上清。

(4)将上清用等体积酚(可省略)、苯酚-氯仿(用前静置过夜)、氯仿依次抽提，混匀后静置，离心(14 000～12 600 r·min-1，5 min)，取上清。

(5)加0.8 BV的异丙醇常温沉淀10～40 min，离心(13 000 r·min-1，15 min)，取沉淀。

(6)将沉淀用70%乙醇清洗，离心(7500 r·min-1，5 min)，取沉淀，烘干后用30 μL无菌水溶解。

(7)DNA的纯化：同CTAB法。

1.5.2 DNA的检测

采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的大小、含量及质量。

(1)制备平板琼脂糖凝胶。

(2)在DNA液中，加入6×loading buffer上样缓冲溶液。

(3)将含上样缓冲溶液的DNA液点入凝胶的加样孔，并以标准DNA(1 kb DNA Ladder)作对照。

(4)蓝色指示剂离胶前沿1/3处；电泳完毕，EB染色30 min，紫外灯下观察、照相。

分离观察大片段时用稀胶(0.8%)、醋酸缓冲溶液(TAE：40 mmol·L-1Tris-醋酸，1 mmol·L-1EDTA)；检测小片段时用浓胶(1.0%)，硼酸缓冲溶液(TBE:0.089 mol·L-1Tris-硼酸，0.0002 mol·L-1EDTA，pH值5.0)。

1.5.3 18S rDNA基因鉴定

使用引物18SF、18SR，以待检菌株的总DNA为模板进行PCR扩增，采用1%琼脂糖电泳观察结果。DNA试剂盒回收PCR 产物,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

18SF：5′-AGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′

18SR：5′-TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3′

反应体系：

ddH2O 34.6 μL，10×LA buffer 5 μL，dNTP 4 μL，18SF 0.5 μL，18SR 0.5 μL，LA Taq酶0.4 μL，模板DNA 5 μL，总体积50 μL。

PCR扩增程序：95 ℃变性8 min；94 ℃变性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸4 min，32个循环；72 ℃延伸8 min。

1.5.4 脂肪酶基因PCR扩增条件的优化

根据不同菌株的脂肪酶基因中的相同区段设计引物TYLipR、TYLipF。

反应体系终体积为25 μL，模板DNA 为原液或稀释液，其余部分用超纯水补足。

使用引物TYLipR、TYLipF，以待检菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,设置反应体系如下：10×LA buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，TYLipR 0.5 μL，TYLipF 0.5 μL，LA Taq酶0.2 μL。

TYLipR：5′-CAGGTTGCCSGCRCTRTCNCC-3′

TYLipF：5′-GTGGTGTAYTTYCAYGGBGG-3′

将模板量、退火温度设为不同梯度，进行PCR 扩增以确定最佳反应体系。PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,记录结果。

1.5.4.1 模板量

以CTAB法提取的DNA为模板(模板量分别设置为：100倍稀释DNA原液、10倍稀释DNA原液、DNA原液)，进行PCR 扩增，然后根据凝胶电泳条带的结果进行调整。

1.5.4.2 退火温度

(1)退火温度首先设置为55 ℃、45 ℃两个梯度。PCR扩增程序为：95 ℃变性3 min；94 ℃变性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸3 min，32个循环；72 ℃延伸5 min。

(2)由于样本出现多条带，所以需对PCR扩增程序进行优化：

95 ℃变性3 min；10 个循环为94 ℃变性0.5 min，50～45 ℃(依次降低0.5 ℃，10次循环至45 ℃)复性0.5 min；72 ℃延伸3 min；后22个循环为94 ℃变性0.5 min,45 ℃复性0.5 min，72 ℃延伸3 min。10 ℃保存。

2 结果与讨论

2.1 DNA提取结果

分别用酶法、CTAB法提取DNA后，取4 μL或5 μL在0.8%琼脂糖凝胶上电泳20 min，结果见图1。

M.Marker 1.4 μL DNA 2.5 μL DNA

由图1可看出，由于初步提取的DNA意外含有大量RNA片段,因此在DNA纯化步骤前应先降解RNA。其添加的RNA酶与溶菌酶混合液中RNA酶浓度一致。

降解RNA后进行DNA纯化，取2.5 μL纯化后的DNA溶液，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳20 min，结果见图2。

M.Marker 1.酶法提取DNA 2.CTAB法提取DNA

由图2可看出，DNA片段较图1降解充分，其中CTAB法提取的DNA片段长度更长，说明基因组DNA更完整，且CTAB法提取的DNA浓度更高，较酶法效果更好；但CTAB法提取DNA的操作过于剧烈，导致DNA断裂比较严重。

2.2 18S rDNA基因鉴定结果

利用引物18SF、18SR进行18S rDNA PCR扩增，回收后取1 μL产物参照3 μL Marker进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。

M.Marker 1.18S rDNA

由图3可知，18S rDNA序列大小为1600 bp。

将18S rDNA送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果见图4。

图4 18S rDNA测序结果

核苷酸序列分析表明，该菌的18S rDNA核苷酸序列与酵母Trichosporonpullulans茁芽丝孢酵母属的同源性高达99%，在细菌系统分类学上，初步鉴定菌株5-1为茁芽丝孢酵母属。

2.3 脂肪酶基因的PCR扩增初步优化结果

2.3.1 DNA模板量的确定

模板为DNA原液及其10倍稀释、100倍稀释的PCR扩增产物的电泳图见图5。

M.Marker 1.空白对照 2.模板为100倍稀释DNA 3.模板为10倍稀释DNA 4.模板为原液DNA 5、6.空白

通过比较，模板为10倍稀释DNA原液、100倍稀释DNA原液时，没有目的基因产生，而克隆的模板为DNA原液时，尽管扩增的目的基因特异性不强，但很明显。因此，后续研究的模板量选择0.5 μL的DNA原液。

2.3.2 退火(复性)温度的确定

不同退火温度时，PCR扩增产物的电泳图见图6。

M.Marker 1.55 ℃ 2.45 ℃ 3、4.空白 5.55～45 ℃梯度降低

由图6可知，退火温度过高(55 ℃)时，引物与模板不易结合，PCR 反应效率降低,目标条带亮度降低甚至消失；退火温度过低(45 ℃)时产生杂带即非特异结合增加；退火温度在55～45 ℃，随着循环梯度降低，增加了特异性片段，主要片段长度由2000 bp以上调整为1～2000 bp。

2.4 讨论

2.4.1 DNA提取方法

本实验用CTAB法和酶法分别提取酵母基因组DNA。结果表明，CTAB法提取的DNA更完整，效果更好，但DNA的纯化不够完善，电泳图显示还有较多杂碎片段；DNA提取过程中，操作不够规范、熟练，极易造成DNA断裂、破碎，进而产生杂碎片段。

为此，提出改进方法：操作中更加仔细、轻柔，如：加SDS后用移液枪头搅拌时，需缓慢轻柔、不要碰管壁等；或者回收DNA琼脂糖电泳条带，再次进行电泳，从而纯化DNA。

2.4.2 PCR扩增条件的优化

在低温脂肪酶基因PCR扩增过程中，通过模板量和退火温度的改变，优化了PCR扩增条件，克隆出明显的目的基因片段，但是扩增结果有多条亮带，特异性不强，原因可能是使用的DNA模板纯化不充分。通过将PCR非特异性条带中1000～3000 bp的基因片段回收纯化、测序，可以在分子水平上更好地研究脂肪酶基因的性质与结构等。

3 结论

以产低温脂肪酶菌株5-1为材料,用酶法和CTAB法分别提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测亮带进行比较，结果表明用CTAB法提取的DNA的完整性更好、浓度更高；该菌株通过18S rDNA基因鉴定，即以待检菌株提取的DNA为模板，以18SF、18SR为引物，进行PCR扩增，由18S rRNA的保守序列分析，鉴定为Trichosporonpullulans茁芽丝孢酵母属；利用脂肪酶的同源基因片段来设计引物，以该菌株的DNA为模板，进行PCR筛选，克隆脂肪酶基因；并对模板量、退火温度两个重要因素进行优化，初步确定最佳PCR扩增条件为：模板量为DNA原液，退火温度为55～45 ℃梯度降低。

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