黄芪总黄酮对大鼠原代成骨细胞的影响及其机制研究

孔祥鹤,牛银波，武祥龙,翟远坤,潘亚磊,李晨睿,梅其炳，2

(1.西北工业大学生命学院,陕西 西安 710072；2.第四军医大学药理教研室,陕西 西安 710032)

随着人口老龄化加剧，骨质疏松症(OP)作为老年人的骨代谢障碍性疾病，发病率高，易引发骨折，引起国内外学者的普遍关注。人们积极寻找疗效确切、副作用小、作用机理明确的抗OP药物。根据成骨细胞在骨形成中的作用，通过判断药物是否能够促进成骨细胞的成骨活性，是开发OP治疗药物的重要手段之一[1]。

中医认为黄芪具有补中益气、升阳固表、托毒敛疮等功效，中医临床常用含有黄芪的方剂、黄芪水煎液等防治骨质疏松[2,3]。对黄芪的化学成分和药理作用研究表明，黄芪黄酮、黄芪多糖为黄芪的主要活性成分，其中黄芪多糖能促进成骨细胞的成骨活性[4]。刘心萍等[5]、陈华庭等[6]研究发现黄芪总黄酮能提高维甲酸致骨质疏松大鼠的骨密度，增强抗外力冲击的能力，提示黄芪总黄酮可能是中药黄芪抗骨丢失的有效部位之一。

作者通过观察黄芪总黄酮(Astragalustotal flavonoids，ATF)对大鼠原代成骨细胞增殖、分化及矿化能力的影响，进一步寻找黄芪抗OP的有效部位；同时观察其是否影响成骨细胞成骨活性相关的骨形成蛋白(BMP-2)、核心结合因子(Runx-2)的表达，以探讨黄芪抗OP的作用机制，为深入研究中药黄芪防治OP提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂及仪器

新生SPF级SD大鼠[合格证号：SCXK(军) 2007-007]，1～3 d龄，购自第四军医大学实验动物中心。

黄芪总黄酮(80%)，西安恒堡生物科技有限公司；DMEM高糖培养基，美国Hyclone公司；胎牛血清，四季青生物制剂公司；雌二醇(E2)、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、EDTA、二甲基亚砜、MTT、茜素红、西吡氯铵，美国Sigma公司；ALP试剂盒，南京建成生物工程研究所；骨Ⅰ型胶原、骨钙素ELISA试剂盒，上海蓝基生物科技有限公司；BMP-2 ELISA试剂盒，美国R&D公司；Runx-2、Histone抗体，美国Bio world公司。

电子分析天平，美国Mettler Toledo公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；Model 680型酶标仪、PAC300型电泳仪，美国Bio-Rad公司；CO2培养箱，德国Heraeus公司；DU800型分光光度计，美国Beckman公司；培养板，丹麦Nunclon公司；高速冷冻离心机，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

实验分为对照组(Control，10%血清培养液)、阳性对照雌激素组(E2，1×10-9mol·L-1雌激素)及各浓度的ATF组(用10%血清培养液配制)。

1.2.2 大鼠原代成骨细胞的分离培养

采用多次酶消化法从新生SD大鼠颅骨获得原代成骨细胞培养体系。

取4只出生1～2 d的SD大鼠，用75%乙醇溶液浸泡消毒5 min，取颅骨放入PBS缓冲溶液中，去除骨膜及周围结缔组织，见骨质发白、透亮，将骨片浸没于1∶4的胰蛋白酶/Ⅰ型胶原酶液中，剪成3 mm×3 mm大小，在5% CO2培养箱中于37 ℃恒温消化30 min。然后加入1 mg·mL-1的Ⅰ型胶原酶，将骨片剪成约1 mm×1 mm大小，于37 ℃恒温消化40 min。离心，去消化液。用含15%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞后接种于细胞培养瓶中，置于培养箱中30 min后成纤维细胞先贴壁，轻轻吸取含成骨细胞的上清液于另一培养瓶中继续培养。细胞传至第2代时换用含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。传至第3代后，可使细胞得到纯化，经碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色鉴定获得较纯的成骨细胞。

1.2.3 MTT法检测成骨细胞增殖

取处于对数生长期的第3代成骨细胞，以每孔3×103个细胞的浓度接种于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中贴壁培养12 h，分组加药(0.001 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、100 μg·mL-1)，空白对照孔只加培养液，不加细胞，用于调零。将96孔板置于培养箱中继续培养24 h、48 h及72 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，继续孵育4 h后终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，室温振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪检测570 nm处各孔吸光度(OD)。

1.2.4 碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨细胞分化

首先观察不同浓度ATF对成骨细胞ALP活性的影响：取处于对数生长期的第3代成骨细胞，以每孔2×105个细胞的浓度接种于24孔板中贴壁培养12 h，分组加药(0.001 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、100 μg·mL-1)，加药6 d后，按照ALP试剂盒说明书进行操作，采用分光光度计测定各组520 nm处吸光度，计算ALP活性(U·mg-1)。

然后观察不同时间点ATF对成骨细胞ALP活性的影响：实验步骤同上，选择上述实验中促进成骨细胞ALP活性的最适给药浓度，分别观察加药2 d、4 d、6 d、8 d后，ATF对成骨细胞ALP活性的影响。

1.2.5 茜素红染色检测成骨细胞矿化

以每孔8×105个细胞的浓度接种于6孔板，贴壁培养12 h后更换含1 μg·mL-1ATF的培养液，并设对照组，在细胞培养箱中每3 d换液1次，连续培养14 d后弃去培养液，PBS清洗3次，用95%乙醇固定1 h，蒸馏水清洗3次，加入40 mmol·L-1茜素红(pH值4.2)染液，于37 ℃孵育15 min，再用蒸馏水清洗3次，在显微镜下观察矿化结节并照相。然后加入100 mmol·L-1西吡氯铵溶液，室温放置1 h，使与钙结合的茜素红充分溶解，用酶标仪于570 nm处测定溶液吸光度，对矿化结节进行量化[7]。

1.2.6 酶联免疫吸附法(ELISA)测定成骨细胞分泌Ⅰ型胶原、骨钙素及BMP-2蛋白的含量

1.2.7 Western blot法检测成骨细胞Runx-2蛋白的表达

首先观察不同时间点ATF对成骨细胞Runx-2表达的影响：取处于对数生长期的第3代成骨细胞，以每孔5×106个细胞的浓度接种于直径为6 cm的无菌培养皿中贴壁培养12 h，ATF给药浓度1 μg·mL-1，分别于0 h、12 h、24 h、48 h后用细胞刮刮下并收集细胞加入RI-PA细胞裂解液(含PMSF蛋白酶抑制剂)提取总蛋白，用酶标仪进行蛋白定量。蛋白变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，将膜浸泡在5%脱脂牛奶中4 ℃封闭过夜，依次加Runx-2、Histone抗体，一抗4 ℃孵育8 h，PBST洗膜后加二抗，室温孵育1 h，用PBST及PBS洗膜后，进行化学发光，对条带进行灰度分析以观察各蛋白表达水平的变化。

然后观察不同浓度ATF对成骨细胞Runx-2表达的影响：分别加入浓度为0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1的ATF，并设对照组，48 h后收集细胞，实验步骤同上。

1.2.8 统计学处理

实验数据采用SPSS 11.0统计软件中的方差分析(ANOVA)进行统计，Western blot条带用Quantity One 4.6.2软件进行灰度值定量分析。

2 结果与讨论

2.1 ATF对原代成骨细胞增殖的影响(图1)

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control，##表示P<0.01 vs ATF(10 μg·mL-1)

由图1可看出，浓度为1 μg·mL-1、10 μg·mL-1的ATF作用于大鼠原代成骨细胞24 h能显著促进细胞增殖(P<0.01)；0.1～10 μg·mL-1的ATF作用48 h后，细胞增殖率显著增强(P<0.01)；0.01～10 μg·mL-1的ATF作用72 h后，能显著促进细胞增殖(P<0.05或P<0.01)。ATF浓度为10 μg·mL-1时促增殖作用最强，而ATF浓度为100 μg·mL-1时开始抑制细胞增殖，其48 h的促增殖作用强于24 h；E2组的作用强于对照组(P<0.01)，与ATF最适浓度(10 μg·mL-1)组相比，24 h及48 h无显著性差异(P>0.05)，在72 h则比ATF组强(P<0.01)。

由于前置胎盘胎盘覆盖于子宫前壁切口位置，传统手术瘢痕可能会影响胎盘移动，最终造成胎盘前置，加之子宫瘢痕内膜过薄，使其绒毛组织侵入到子宫肌层中，使其胎盘植入几率明显提升。在进行本次研究发现，全部患者均符合手术病理标准，患者经过在腹彩超多普勒超声的检查发现，其诊断率为95.5%（85/89），漏诊率4.9%（4/89）。对此，前置胎盘并发胎盘植入临床诊断中，腹彩色超声多普勒具有较高准确率，且呈现无创安全的特点，具备临床推广与使用价值。

2.2 ATF对原代成骨细胞ALP活性的影响(图2)

**表示P<0.01 vs Control，#表示P<0.05 vs ATF(1 μg·mL-1)

由图2a可看出，加药6 d后，ATF组浓度在0.01～1 μg·mL-1时能剂量依赖性地促进成骨细胞的ALP活性(P<0.01)，1 μg·mL-1时促进作用最强；ATF浓度在10～100 μg·mL-1时，促进作用下降。因此，选择ATF最适浓度为1 μg·mL-1。观察其在第2 d、4 d、6 d、8 d对成骨细胞的ALP活性的影响(图2b)，结果发现，从第4 d开始，ATF组及E2组开始促进ALP活性(P<0.01)，第6 d达到最高，第8 d又开始下降；第6 d时E2组比ATF组强(P<0.05)。

2.3 ATF对原代成骨细胞矿化的影响(图3)

**表示P<0.01 vs Control，#表示P<0.05 vs ATF(1 μg·mL-1)

由图3可看出，细胞连续培养14 d，各组在不同的时间内出现了肉眼可见的白色结节，茜素红染色后呈现大小、形态不一的红色阳性结节；E2组及1 μg·mL-1ATF组与对照组相比均显著增加了成骨细胞矿化结节的数量(P<0.01)，E2组的作用较ATF组强(P<0.05)。

2.4 ATF对原代成骨细胞分泌Ⅰ型胶原、骨钙素的影响

在原代成骨细胞中加入1 μg·mL-1的ATF，用ELISA法检测细胞上清中分泌Ⅰ型胶原及骨钙素的表达，结果见图4。

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control，#表示P<0.05 vs ATF(1 μg·mL-1)

由图4可看出，培养2 d后ATF对Ⅰ型胶原、骨钙素蛋白表达无明显影响；第4～8 d ATF则显著促进Ⅰ型胶原、骨钙素蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)；第6～8 d时E2组的作用强于ATF组(P<0.05)。

2.5 ATF对原代成骨细胞BMP-2、Runx-2蛋白表达的影响

用ELISA法检测细胞上清中分泌型BMP-2蛋白的表达，结果见图5。

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control

由图5可看出，在0～24 h，BMP-2蛋白的表达逐渐升高，24 h达到最高，48 h时BMP-2蛋白的表达反而下降。表明，6～24 h，ATF能显著促进BMP-2蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。

用Western blot法检测细胞中Runx-2蛋白的表达，结果见图6。

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control

由图6可看出，在0～48 h，Runx-2蛋白的表达逐渐升高，在48 h 达到最高(图6a)；0.1 μg·mL-1及1 μg·mL-1ATF能显著促进Runx-2蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)，且呈剂量依赖性变化(图6b)。

2.6 讨论

2.6.1 ATP对原代成骨细胞增殖、分化及矿化影响的讨论

(1)成骨细胞不仅决定骨形成，同时也调节破骨细胞的骨吸收，是骨代谢的重要功能细胞。成骨细胞的增殖与分化受到抑制，从而使骨质量和骨量下降，骨小梁稀疏、断裂，是导致骨质疏松的病理机制之一。因此防治骨质疏松的关键是提高成骨细胞的增殖和分化水平。用MTT法检测细胞增殖的原理是：增殖的活细胞通过线粒体能量代谢，将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的结晶(甲瓒)沉积在细胞内和细胞周围，形成的结晶与增殖的活细胞数成正比。本研究发现，ATF能显著促进大鼠原代成骨细胞增殖，浓度为10 μg·mL-1时促增殖作用最强，而ATF浓度为100 μg·mL-1时开始抑制细胞增殖。

(2)碱性磷酸酶ALP是参与骨代谢的重要蛋白质，是识别和评价成骨细胞分化程度的早期指标。Ⅰ型胶原蛋白及骨钙素的合成及分泌是成骨细胞分化成熟的标志。本研究发现，ATF浓度为0.01～1 μg·mL-1时，能剂量依赖性地促进成骨细胞的ALP活性(P<0.01)，ATF浓度为1 μg·mL-1、给药6 d时的促进作用最强，第6 d时阳性对照E2组比ATF组强(P<0.05)。同时，浓度为1 μg·mL-1的ATF给药4～8 d能显著促进Ⅰ型胶原及骨钙素的表达(P<0.05或P<0.01)。

(3)细胞进入分化末期后，细胞局部聚集形成细胞团，相互促进成熟，胞体变小，随着矿化基质的增多而逐渐被埋入其内，最终形成明显的矿化结节。矿化结节的形成是成骨细胞体外成骨的重要标志之一，是成骨功能的形态表现[8]。本研究发现，与对照组相比，1 μg·mL-1ATF组显著增加了成骨细胞矿化结节的数量(P<0.01)。

ATF对成骨细胞增殖、分化及矿化的促进作用虽弱于阳性对照E2组，但是雌激素对子宫具有明显的刺激作用[9]，而未见报道ATF有明显的毒副作用。

2.6.2 ATF对原代成骨细胞BMP-2、Runx-2蛋白表达影响的讨论

骨形态发生蛋白系列(Bone morphogenetic proteins，BMPs)属于转化生长因子-β(Transforming growth factor，TGF-β)超家族，是调节成骨细胞生长最重要的生长因子。其中以BMP-2活性最强，其对人骨髓间充质干细胞有强烈的成骨诱导活性，而且能使诱导性骨细胞向确定性骨细胞转化，从而促进骨形成[10]。核心结合因子αl(Core binding factorαl，Cbfαl，Runx-2)是近来发现的成骨细胞特异性转录因子，在成骨细胞的分化成熟以及骨形成中起着关键性的作用[11]，可调节骨钙素、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨涎蛋白等骨基质蛋白的表达[12]。本研究发现，1 μg·mL-1ATF能显著促进大鼠原代成骨细胞BMP-2、Runx-2蛋白的表达，提示ATF促进大鼠原代成骨细胞成骨活性的作用机理，可能是通过上调骨形成蛋白BMP-2的表达，以激活其下游细胞核内与细胞增殖分化密切相关的转录因子Runx-2表达，最终促进细胞的增殖、分化。

3 结论

黄芪总黄酮能促进大鼠原代成骨细胞的增殖、分化与矿化，从细胞水平为黄芪总黄酮抗骨质疏松提供有力依据。其作用机制可能是通过上调BMP-2的表达，激活下游的转录因子Runx-2表达，以促进细胞的成骨活性。天然产物的成分非常复杂，其作用不可能用一两种机制就能解释清楚，而骨质疏松本身也是一种多因素、多环节的疾病，治疗中需要标本兼治、整体调节方能奏效，这也是中医药治疗的特色。为确保中药质量标准化，使其更好地走向市场，走向国际，进一步明确中药的活性成分及药理机制是十分必要的。

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