一株梅花鹿粪便链霉菌化学成分的分离与鉴定

李 鑫，韩 力，曹艳茹，刘 江，姜 怡，黄学石

(1.中国医科大学 代谢病分子机制与药物研究所，辽宁 沈阳 110001；2.云南大学 云南省微生物研究所 微生物药物国家工程研究中心，云南 昆明 650091)

作者从梅花鹿粪便中分离得到一株链霉菌，并对其化学成分进行了鉴定。

1 实验

1.1 菌株

菌株于2009年从昆明野生动物园健康成年梅花鹿的粪便中分离得到，由云南大学云南省微生物研究所姜怡博士鉴定为链霉菌(Streptomycessp.)，微生物样品保存于云南大学云南省微生物研究所，菌株编号YIM 100471。

1.2 材料、试剂与仪器

薄层色谱硅胶GF254、薄层色谱硅胶H、柱色谱硅胶(100～200目，200～300目)，青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20，Pharmacia公司；其它试剂均为国药集团化学试剂有限公司的分析纯试剂。

Varian Mercury-VX 300 MHz型核磁共振仪；Finnigan LCQ型质谱仪，Thermo。

1.3 提取与分离

菌株分离纯化后，用改良61号培养基(蛋白胨2 g、葡萄糖20 g、可溶性淀粉5 g、酵母膏2 g、NaCl 4 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO32 g、H2O 1 L，pH值7.8)发酵培养70 L，滤出菌丝体。发酵液用XAD-16大孔树脂柱处理，依次用水、20%乙醇、95%乙醇洗脱。收集95%乙醇洗脱部分，合并洗脱液，浓缩蒸干得到粗提物22 g。粗提物经硅胶柱色谱分离、二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，得到10个馏分(Fr.1 ～ Fr.10)。Fr.3经反复硅胶柱色谱分离、石油醚-乙酸乙酯溶液梯度洗脱，得化合物Ⅴ(6 mg)和Ⅵ(25 mg)；Fr.7经Sephadex LH-20柱色谱、硅胶柱色谱分离得到化合物Ⅰ(10 mg)、Ⅱ(6 mg)和Ⅳ(11 mg)；Fr.8经硅胶柱色谱分离得到化合物Ⅲ(23 mg)。

1.4 结构鉴定

分别对分离得到的化合物Ⅰ～Ⅵ进行1HNMR、13CNMR、MS鉴定。

2 结果与讨论

从菌株发酵液的95%乙醇提取物中分离得到了6个已知化合物，其波谱数据分析如下：

化合物Ⅰ：白色固体，ESI-MS，m/z:296[M+H]+，确定化合物Ⅰ的分子质量为295。1HNMR(300 MHz,DMSO-d6),δ:8.37(1H,s,H-8),8.21(1H,s,H-2),5.90(1H,d,J=6.0 Hz,H-1′),5.46(1H,d,J=5.7 Hz,OH),5.38(1H,brt,J=5.7 Hz,OH),5.20(1H,d,J=3.6 Hz,OH),4.67(1H,brq,J=5.1 Hz),4.14(1H,m),3.96(1H,brq,J=3.6 Hz),3.67(1H,dt,J=11.7 Hz,4.0 Hz,H-5′),3.55(1H,ddd,J=11.7 Hz,6.6 Hz,3.7 Hz,H-5′),3.35(6H,s,Me)。13CNMR(75 MHz,DMSO-d6),δ:151.8(C-2),150.0(C-4),119.9(C-5),154.4(C-6),138.7(C-8),87.9(C-1′),73.6(C-2′),70.6(C-3′),85.8(C-4′),61.6(C-5′),38.1(6-NCH3,宽峰)。上述数据与文献[1]报道的6-N,N-二甲基腺苷的波谱数据基本一致。故确定化合物Ⅰ为6-N,N-二甲基腺苷，其结构式见图1。

化合物Ⅱ：白色固体，ESI-MS，m/z:298[M+H]+，320[M+Na]+，确定化合物Ⅱ的分子质量为297。1HNMR(300 MHz,DMSO-d6),δ:8.36(1H,s,H-8),8.15(1H,s,H-2),7.30(2H,brs,NH2),5.88(1H,d,J=6.0 Hz,H-1′),5.50(1H,d,J=6.0 Hz,OH),5.32(1H,d,J=4.2 Hz,OH),4.75(1H,brq,J=5.4 Hz),4.14(1H,m),4.03(1H,m),2.88(1H,dd,J=13.9 Hz,5.9 Hz,H-5′),2.78(1H,dd,J=13.9 Hz,7.0 Hz,H-5′),2.05(3H,s,SMe)。13CNMR(75 MHz,DMSO-d6),δ:152.8(C-2),149.6(C-4),119.8(C-5),156.2(C-6),139.9(C-8),87.4(C-1′),72.7(C-2′),72.7(C-3′),83.8(C-4′),36.1(C-5′),15.6(5′-SMe)。上述数据与文献[2]报道的5′-甲硫基腺苷的波谱数据基本一致。故确定化合物Ⅱ为5′-甲硫基腺苷，其结构式见图1。

化合物Ⅲ：白色粉末，紫外254 nm下观察有暗斑点，与1%(体积分数)香草醛硫酸试剂反应显暗蓝色。化合物Ⅲ与胸腺嘧啶脱氧核苷对照品[3]共薄层，在3种展开系统下，Rf值及斑点显色均一致。故确定化合物Ⅲ为胸腺嘧啶脱氧核苷，其结构式见图1。

化合物Ⅳ：白色粉末，ESI-MS，m/z：261[M+H]+，确定化合物Ⅳ的分子质量为260。1HNMR(300 MHz,DMSO-d6),δ：8.15(1H，d，J=4.2 Hz，NH)，7.12～7.30(5H，m，H-2′，H-6′)，5.00(1H，brs，OH),4.11(1H，m，H-6)，3.97(1H，brq，J=5.1 Hz,H-3),3.45(1H，dd，J=12.1 Hz，3.3 Hz，H-1″),3.18(1H，m，H-2″)，3.14(1H，m，H-1″)，3.02(1H，dd，J=13.5 Hz，6.6 Hz，H-7′)，2.91(1H，dd，J=13.5 Hz，5.1 Hz，H-7′)，2.11(1H，m，H-3″)，1.84(1H，m，H-3″)。13CNMR(75 MHz,DMSO-d6),δ：168.3(C-2)，55.5(C-3)，165.2(C-5)，57.9(C-6)，136.3(C-1′)，129.8(C-2′,C-6′)，128.4(C-3′，C-5′)，126.9(C-4′)，39.2(C-7′)，52.9(C-1″)，66.7(C-2″)，36.9(C-3″)。上述数据与文献[4]报道的环-(苯丙氨酸-羟脯氨酸)-二肽的波谱数据基本一致。故确定化合物Ⅳ为环-(苯丙氨酸-羟脯氨酸)-二肽，其结构式见图1。

化合物Ⅴ：淡黄色粉末，紫外254 nm下观察有暗斑点，与1%(体积分数)香草醛硫酸试剂反应显深紫色。化合物Ⅴ与吲哚-3-甲酸对照品[5]共薄层，在3种展开系统下，Rf值及斑点显色均一致。故确定化合物Ⅴ为吲哚-3-甲酸，其结构式见图1。

化合物Ⅵ：白色粉末，紫外254 nm下观察有暗斑点，与1%(体积分数)香草醛硫酸试剂反应显鲜红色。化合物Ⅵ与对羟基苯乙醇[6]对照品共薄层，在3种展开系统下，Rf值及斑点显色均一致。故确定化合物Ⅵ为对羟基苯乙醇，其结构式见图1。

图1 化合物Ⅰ～Ⅵ的结构式

3 结论

从链霉菌发酵液的95%乙醇提取物中分离得到6个已知化合物，分别鉴定为6-N，N-二甲基腺苷(Ⅰ)、5′-甲硫基腺苷(Ⅱ)、胸腺嘧啶脱氧核苷(Ⅲ)、环-(苯丙氨酸-羟脯氨酸)-二肽(Ⅳ)、吲哚-3-甲酸(Ⅴ)、对羟基苯乙醇(Ⅵ);6个化合物均为首次从该菌株中分离得到。

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