HPLC法测定金匮肾气丸中马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚

林 林， 刘广桢， 尹宁宁

(山东省食品药品检验所，山东济南250101)

金匮肾气丸源于《金匮要略》，在古方的基础上，经过加味牛膝、车前子后形成今方的金匮肾气丸，具有温补肾阳，化气行水。用于肾虚水肿，腰膝酸软，小便不利，畏寒肢冷等症。现行质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第二十册［1］，仅收载有牛膝的薄层鉴别项，无含量测定项。本实验参考相关文献中马钱苷［2-5］、丹皮酚［6-8］、毛蕊花糖苷［9-11］和芍药苷［12-14］的定量测定方法，增加了处方中山茱萸、牡丹皮、车前子、地黄等药味有效成分马钱苷、丹皮酚、芍药苷、毛蕊花糖苷的定量测定。通过方法学验证，该方法操作简便、准确、重复性好，有利于对金匮肾气丸进行质量评价。

1 仪器与试药

Waters2765-2998高效液相色谱仪，Waters色谱工作站，Mettler AE240电子天平 (瑞士梅特勒公司);马钱苷 (批号:111640-200604)，芍药苷(批号:110736-200833)，毛蕊花糖苷 (批号:111530-200706)， 丹 皮 酚 (批 号:110708-200505)，均购自中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯;甲醇、磷酸为分析纯。金匮肾气丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号:1035901;北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号:1035904;山东大陆药业有限公司，批号:110512)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo Hypersil BDS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈为流动相A，0.01%磷酸为流动相B，按梯度洗脱 (见表1);体积流量1mL/min，检测波长0～17 min，237 nm;18～25 min，233 nm;25～40 min，330 nm;40～55 min，275 nm。柱温35℃。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚对照品适量，加80%甲醇制成质量浓度为37.82、53.52、76.51、64.70 μg/mL的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取供试品适量，研细，取2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

表1 梯度洗脱顺序Tab.1 Gradient elution mode of mobile phase

2.4 阴性对照溶液的制备 取不加山茱萸的阴性样品、不加牡丹皮的阴性样品、不加车前子和地黄的阴性样品按供试品溶液的制备项下的方法，分别制得缺山茱萸阴性对照溶液、缺牡丹皮阴性对照溶液和缺地黄、车前子阴性对照溶液。

2.5 方法的专属性考察 取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液按2.1项下色谱条件进行测定。结果表明马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚分离度良好，阴性无干扰。见图1。

2.6 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液2、5、10、15、25 μL，按2.1项下色谱条件进行测定。由进样量 (C)对峰面积 (A)求得工作曲线，得到回归方程。马钱苷:A=1783751.40C－2635.78，r=0.9997，线性范围:0.0756 ～0.9455 μg。芍药苷:A=893557.46C－1335.73，r=0.9999，线性范围:0.1070～1.3381 μg。毛蕊花糖苷:A=1020214.99C+2766，r=0.9998，线性范围:0.1530 ～1.9127 μg。丹皮酚:A=5307383.59C+4106.68，r=1.0000，线性范围:0.1294～1.6175 μg。结果表明马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚在上述范围内呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验 取同一批金匮肾气丸 (批号1035904)供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积积分值。计算得马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚的RSD值分别为0.86%、1.24%、0.67%、0.21%。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、3、6、9、12、15 h测定，结果马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚的 RSD值分别为0.68%、1.27%、0.81%、0.19%。结果表明供试品溶液在15 h内稳定。

图1 缺山茱萸阴性对照样品 (A)、缺牡丹皮阴性对照样品 (B)、缺地黄、车前子阴性对照样品 (C)混合对照品 (D)和金匮肾气丸样品 (E)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of negative sample without Corni Fructus(A)，negative sample without Moutan Cortex(B)，negative sample without Plantaginis Semen and Rehamnniae Radix(C)，mixed reference substances(D)and Jinkui Shenqi Pills(E)

2.9 重复性试验 取同一批金匮肾气丸 (批号1035904)，按照供试品溶液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定并计算，结果马钱苷平均质量分数为0.2782 mg/g，RSD为0.81%;芍药苷平均质量分数为0.5873 mg/g，RSD为1.61%;毛蕊花糖苷平均质量分数为0.7426 mg/g，RSD为0.59%;丹皮酚平均质量分数为0.7440 mg/g，RSD为0.48%。结果表明本方法的重复性良好。

2.10 加样回收试验 取金匮肾气丸 (批号1035904)适量，精密称取6份，每份1.0 g(约相当于马钱苷0.2782 mg、芍药苷0.5873 mg、毛蕊花糖苷0.7426 mg、丹皮酚0.7440 mg)，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液10 mL(马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚质量浓度分别为0.02715 mg/mL、0.05884 mg/mL、0.07294 mg/mL、0.07314 mg/mL)，再精密加入80%甲醇40 mL，按供试品溶液制备方法进行制备并测定。结果表明该方法的回收率良好。结果见表2～5。

2.11 样品的测定 取不同厂家金匮肾气丸样品3批，进行含有量测定。结果见表6。

表2 马钱苷加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery test of loganin

表3 芍药苷加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests of paeoniflorin

3 讨论

3.1 提取溶媒的选择 分别以甲醇、80%甲醇、50%甲醇为提取溶剂，超声处理30 min，进行提取，结果以80%甲醇提取效率最高，故选择80%甲醇为提取溶媒。

表4 毛蕊花糖苷加样回收率试验结果Tab.4 Results of recovery tests of verbascoside

表5 丹皮酚加样回收率试验结果Tab.5 Results of recovery tests of paeonol

表6 样品测定结果(n=3)Tab.6 Determination results of samples(n=3)

3.2 提取方法的选择 以80%甲醇为溶媒，分别进行超声15 min、30 min、60 min;加热回流1 h、2 h考察。实验结果表明，加热回流会导致丹皮酚含量降低，超声30 min和60 min效果相当，故提取方法确定为超声处理30 min进行提取。

3.3 检测波长的选择 由于所用液相的检测器为紫外二极管检测器，设定波长范围210～400 nm进行扫描，结果马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚分别在237 nm、233 nm、330 nm、275 nm波长处吸收最大，因此采用波长切换法进行测定，检测波长设定为:0～17 min，237 nm;18～25 min，233 nm;25 ～ 40 min，330 nm;40 ～ 55 min，275 nm。

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