金莲花中荭草苷对人食管癌EC-109肿瘤细胞生长及凋亡的影响

朱登祥， 安 芳， 王书华

(河北北方学院药学系，河北张家口075000)

金莲花是毛茛科植物金莲花Trollius chinensis Bunge的干燥花及花蕾，广泛分布于西南、西北、华北、东北地区。《本草纲目拾遗》谓其“味苦，性寒，无毒”，可“治口疮、喉肿、浮热牙宣、耳疼、目痛”，并具“明目、解岚障”之功效。前期研究发现，金莲花总黄酮具有抗氧化、抗肿瘤等作用［1-4］。荭草苷在金莲花总黄酮中较高［5］，属于黄酮碳苷类化合物，具有抗氧化、对缺血缺氧心肌良好的保护作用［6-7］，与抗肿瘤作用较强的木犀草素［8］具有相似的化学结构。经对国内外文献检索尚未见金莲花中荭草苷抗肿瘤作用的研究报道。本研究在金莲花总黄酮抗肿瘤研究基础上，进一步观察荭草苷对人食管癌EC-109细胞的抗瘤作用，为确立金莲花黄酮抗肿瘤药效物质基础提供实验依据。为抗肿瘤药物的研制与开发提供新的动力。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 EC-109细胞 (购自北京肿瘤研究所遗传室);细胞培养基RPMI 1640(美国Gibico公司);胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司);CCK-8试剂盒 (上海玛芝佳公司);细胞凋亡Hoechst染色试剂盒 (晶美生物工程有限公司);Annexin V-FITC试剂盒 (碧云天试剂公司);琼脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)。全自动荧光酶标仪 (Spectra Max，美国分子仪器有限公司);凝胶成像系统 (BioSpectrumAC system，美国 UVP公司);流式细胞仪 (FCM，FACS-Aria美国BD公司);ECLIPSE Ti-U荧光倒置显微镜 (日本 Nikon公司);3319型 CO2培养箱(美国Forma公司)。

1.2 荭草苷制备及鉴定［9］

1.2.1 荭草苷提取 称取一定量洁净、干燥、粉碎的金莲花，丙酮脱色素，滤渣干燥后，60%乙醇浸泡，回流提取，滤液减压浓缩、离心，收集上清液，上清液经AB-8大孔吸附树脂纯化，先用4倍体积的蒸馏水洗去杂质，再依次用4倍体积的10%、70%、95%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液。洗脱液经乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩、真空干燥成固体。得荭草苷粗品。

1.2.2 高效液相色谱分离纯化荭草苷 ZORBAX SB-C18色谱柱 (21.2 mm×250 mm，7 μm);流动相为1%乙酸-乙腈 (85∶15);柱温25℃;体积流量20 mL/min;检测波长340 nm;进样量6 mL;馏分收集:基于峰，阈值Min为2.2。

将荭草苷粗品用适量流动相溶解 (超声助溶)，过0.45 μm微孔滤膜后，在制备型高效液相色谱条件下进样，将收集得到的荭草苷馏分，减压浓缩，在－50℃下，真空冷冻干燥，即得淡黄色晶体粉末荭草苷。

1.2.3 高效液相色谱检测荭草苷纯度 Hypersil BDS-C18色谱柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相为1%乙酸-乙腈 (85∶15);检测波长为340 nm。柱温30℃。体积流量1 mL/min，进样量20 μL。将制备所得荭草苷纯品配成一定浓度的供试品溶液 (3份)，按色谱条件进行测定 (平行进样5次)。

1.2.4 NMR鉴定荭草苷结构 将制备所得荭草苷经NMR进行结构鉴定，并与标准品进行对照。

1.3 荭草苷对EC-109细胞生长及凋亡的影响

1.3.1 细胞培养与分组 人食管癌EC-109细胞于37℃饱和湿度、5%CO2条件下，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养，在对数生长期进行传代分组实验。实验分组，空白对照组、溶剂对照组 (荭草苷难溶于水，选DMSO为助溶剂，DMSO终质量分数为0.2%)、药物组 (荭草苷终浓度分别为5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μmol/L)、金莲花总黄酮为阳性对照组 (质量浓度0.793 g/L［3］)。

1.3.2 细胞生长增殖抑制率检测 采用CCK-8(cell counting kit)法。取对数生长期的EC-109细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，细胞计数，调整细胞密度，取100 μL单细胞悬液加入96孔板，使每孔细胞1×105个。待细胞贴壁后，轻轻吸去上清，按实验分组加入相应的药物100 μL，达到终浓度要求。对照组与荭草苷不同浓度组各设5个复孔，加入药物，培养至24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8液，继续培养4 h，采用全自动酶联免疫检测仪在450 nm波长测定吸光度值，计算药物对癌细胞的平均抑制率。

1.3.3 Hoechest33258染色观察EC-109细胞形态EC-109细胞以每孔900 μL(含5×103细胞)接种于24孔培养板。培养6 h，细胞贴壁后加入100 μL不同处理因素，使荭草苷终浓度为5.0，20.0，80.0 μmol/L。空白对照组不含处理因素。培养48 h后Hoechst33258染色，以紫外光340 nm波长激发，荧光显微镜下观察、拍照。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder 调整细胞密度为1×106/mL接种于20 mL的培养瓶，2.5 mL/瓶，待细胞贴壁后，加入药物，荭草苷终浓度为5.0，20.0，80.0 μmol/L三组，设空白对照组。培养48 h后，收集细胞，用PBS洗涤3次，最后1次移入1.5 mL EP管中，加裂解液615 μL，70℃水浴振荡15 min，重复2次，离心取上清液500 μL，加1000 μL的无水乙醇使DNA析出，离心后用20 μL TE缓冲液 (pH7.4)溶解DNA，按照试剂盒的操作步骤进行琼脂糖凝胶电泳，电泳前，用RNA酶 (10 g/L)消化30 min，2%琼脂糖凝胶电泳60 min，采用凝胶成像系统观察并拍照。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞早期凋亡 实验分组及药物作用时间同1.3.4项。收集对照组及不同浓度药物作用的EC-109细胞，每组细胞计数为1×106个，离心，弃上清，用冷PBS洗涤2次，按照Hoechst染色试剂盒的说明操作，流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。

2 结果

2.1 荭草苷纯度及结构鉴定 高效液相色谱检测荭草苷样品纯度为98.8%，RSD为1.1%。HNMR鉴定荭草苷标准品与制备荭草苷样品活泼氢化学位移值一致。

2.2 荭草苷对EC-109细胞生长增殖的抑制作用不同浓度的荭草苷对EC-109细胞生长增殖抑制率见表1。

表1 荭草苷对EC-109细胞生长增殖抑制作用(±s，n=5)Tab.1 Inhibitory effect of the growth of orientin in EC-109 cell(±s，n=5)

表1 荭草苷对EC-109细胞生长增殖抑制作用(±s，n=5)Tab.1 Inhibitory effect of the growth of orientin in EC-109 cell(±s，n=5)

荭草苷/(mol·L －1)抑制率/%24 h 48 h 72 h 5.0 5.23±0.12 10.82±0.23 18.38±0.1610.0 8.03±0.20 21.06±0.32 36.65±0.5620.0 14.35±0.43 30.02±0.88 48.78±0.5840.0 20.43±0.51 36.90±0.67 51.04±0.6680.0 34.08±1.16 44.60±1.45 58.80±1.110.2%DMSO 0.66±0.23 0.58±0.15 0.49±0.44

实验数据显示DMSO对细胞活性及增殖几乎没有影响，最大抑制率没有超过1%，后面实验不再设试剂对照组。实验结果表明，同一时相，不同浓度荭草苷对EC-109细胞生长增殖抑制率随着用药浓度的增高而增高 (P＜0.05)，不同时相，同一浓度荭草苷对EC-109细胞抑制率随时间延长而增加，具有显著性差异 (P＜0.05)。前期研究表明，金莲花总黄酮，质量浓度0.793 g/L，作用时间24 h时，对EC-109细胞生长增殖抑制率为28.00%［3］。本研究表明，当荭草苷浓度 80.0 μmol/L(=0.0359 g/L)、作用时间24 h时，其对EC-109细胞生长增殖抑制率为34.08%，提示荭草苷可能是金莲花总黄酮中对EC-109细胞生长增殖抑制作用的药效物质之一，且抗瘤活性优于金莲花总黄酮。

2.3 荭草苷对EC-109细胞核荧光形态的影响 空白对照组细胞核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，在紫外线下呈均一的蓝色荧光，可见处于分裂期的细胞。经荭草苷处理的细胞出现典型的凋亡形态学改变，即胞体缩小，核染色质染色明亮，出现核浓缩、分叶、边集、核染色质碎裂。随着药物浓度增大，凋亡细胞数逐渐增多。见图1。

图1 荭草苷对EC-109细胞核形态的影响 (×400)Fig.1 Affection of orientin in EC-109 cell nuclear shape

2.4 荭草苷对EC-109细胞DNA的影响 空白对照组没有出现梯形DNA Ladder(DNA条带)，而80.0 μmol/L 药物组，出现明显 Ladder，20.0 μmol/L、5.0 μmol/L药物组的条带较模糊、变暗，但也有较明显的效果，见图2。

2.5 荭草苷对EC-109细胞凋亡率的影响 AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测结果显示，不同浓度荭草苷均可诱导EC-109细胞凋亡，其凋亡率随浓度的增大而增加，且不同浓度荭草苷之间凋亡率相比较有显著性差异 (P＜0.05);较对照组细胞凋亡率显著升高 (P＜0.01)。结果见表2和图3。

3 讨论

图2 不同浓度荭草苷对EC-109细胞的影响Fig.2 Affection of orientin in EC-109 cell

表2 不同浓度荭草苷对EC-109细胞凋亡的影响 (±s，n=5)Tab.2 Affection of orientin in EC-109 cell apoptosis(±s，n=5)

表2 不同浓度荭草苷对EC-109细胞凋亡的影响 (±s，n=5)Tab.2 Affection of orientin in EC-109 cell apoptosis(±s，n=5)

样品 浓度/(mol·L－1) 凋亡率/%0.64±0.12荭草苷 5.0 3.36±0.2020.0 7.21±0.34对照组80.0 28.03±0.64

近年来，许多新药包括紫杉醇、草酸铂、伊立替康等应用于食管癌的治疗。金莲花黄酮类物质具有抗氧化、抗肿瘤等作用，研究金莲花黄酮单体荭草苷抗肿瘤作用有无及强弱是进一步探索金莲花黄酮药效物质基础的开始，为抗肿瘤药物开发和理论研究打下基础。

图3 FCM检测荭草苷对EC-109细胞凋亡的影响Fig.3 Detectiong the apoptosis rate of EC-109 cell by FCM

本研究表明，荭草苷在5.0～80.0 μmol/L浓度下，有明显抑制食管癌细胞生长增殖的作用，药物浓度越高、时间越长，抑制率越高。从时间—剂量效应走势来看，同一时相，高浓度组起初作用明显，随浓度增高，抑制率增高，对同一剂量组来说，未呈现剂量-时间对抑制率的线性正比例关系。提示，理想的药物作用浓度应该在5.0～80.0 μmol/L之间，癌细胞生长增殖被抑制。不同时相，同一浓度荭草苷对EC-109细胞抑制率为均为20 h＜48 h＜72 h，但未呈现正比例关系。48 h与24 h、48 h与72 h比较，抑制率均具有显著性差异，提示，研究EC-109细胞的早期凋亡，在48 h检验效果应较好。所以后面的三个检验细胞凋亡的实验，药物作用时间定在48 h。在细胞早期凋亡发生时，细胞核内DNA可控制降解，形成不同长度的核酸片段，这和细胞坏死，DNA降解不同，所以DNA Ladder的出现，意味着凋亡的发生。采用琼脂糖凝胶电泳与Hoechest33258染色细胞形态学相结合的实验方法，结果显示荭草苷具有对EC-109细胞生长抑制效应和诱导凋亡效应，且呈浓度依赖性关系。检测细胞凋亡，FCM是权威的检测手段，其不仅能够定量分析，还可以区分统计坏死的细胞。本实验中，FCM检测荭草苷具有诱导EC-109细胞凋亡作用，且呈现剂量依赖性，随药物浓度的增加凋亡的发生率也随之增加 (P＜0.05)。值得注意的是，FCM检测图显示，伴随着凋亡细胞的增多，死亡细胞数目也在同步增加。

综上分析，荭草苷对EC-109细胞具有抑制细胞生长增殖作用，能够诱导食管癌EC-109细胞出现早期凋亡。由此可见荭草苷作为一种黄酮碳苷有可能成为一种新型抗食管癌的药物。

致谢:本实验荭草苷H-NMR数据在中科院化学所核磁组完成。

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