HPLC法测定合欢皮抗新生血管有效部位中的总皂苷

施建军， 谭 莹， 杜 斌， 钱建瑛， 冯 磊， 邱丽颖

(江南大学医药学院，江苏无锡214122)

合欢皮是豆科植物合欢Albizzia julibrissin Durazz的树皮，为常用的传统中药，具有解郁安神、活血消肿之功效［1］。现代药理学研究发现，合欢皮具有抗肿瘤作用［2］。合欢皮具有抑制血管内皮细胞的活性［3-4］。在以抗肿瘤新生血管的生理活性指标下，分离纯化得到了合欢皮提取物，定性鉴别分析确定了该活性组分群为皂苷类化合物［5］。前期实验和文献报道表明合欢皮中目前已鉴定的皂苷的苷元多为齐墩果酸［6］。由于目前尚未有通过国家鉴定的合欢皮总皂苷对照品，测定合欢皮总皂苷的方法主要是紫外分光光度法［7-8］，虽然该方法所需设备及操作简单，易普及推广，灵敏度、准确度、重复性较高，应用范围广;但其专属性较差，对许多物质均有显色反应，且易受环境因素、仪器等影响。本实验选用齐墩果酸为参照对照品，通过酸水解合欢皮中的总皂苷，得到齐墩果酸苷元，建立合欢皮中总皂苷的HPLC定量测定方法，以齐墩果酸的含有量代表总皂苷的含有量，同时对该方法进行可行性分析。

1 仪器和试药

HITACHI高效液相色谱仪，电子天平［梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司］，电热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽 (上海精宏实验设备公司)。齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供 (110709-200505)，合欢皮生药材由无锡山禾集团中药饮片厂提供 (20070418)，乙腈和甲醇为色谱纯，水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 原药及样品溶液的准备

2.1.1 原药的制备 取合欢皮，粉碎，加10倍量75%乙醇溶液，加热回流，冷却过滤，旋转蒸发至干，去离子水复溶，60℃真空干燥。取干粉，加去离子水溶解，等体积水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇相，旋转蒸发至干，回收溶剂，加水复溶，60℃真空干燥，得原药。

2.1.2 对照品溶液的制备 精确称取齐墩果酸对照品粉末1.5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得贮备液，每1 mL含齐墩果酸0.15 mg。

2.1.3 供试品的制备 精密称取原药0.2 g，按2.3.2项单因素和2.3.3项正交实验方法制得的水解物，用甲醇定容至10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，4℃保存备用。

2.1.4 阴性样品1的制备 取200 mg原药，用甲醇定容至10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，4℃保存备用。

2.1.5 阴性样品2的制备 原药按2.3.2项方法酸解过滤后，在石油醚提取前，将沉淀直接加甲醇定容至5 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，4℃保存备用。

2.1.6 阴性样品3的制备 原药按2.3.2项方法酸解后将滤液与洗液合并，加NaOH溶液将pH调至中性，减压蒸干溶剂，加甲醇定容至5 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，4℃保存备用。

2.2 HPLC测定齐墩果酸方法学考察

2.2.1 色谱条件 WondaSilTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相乙腈-水 (90 ∶10);检测波长210 nm;柱温30℃;体积流量1 mL/min。理论板数以齐墩果酸计算应不低于3000。

2.2.2 线性关系考察 精密量取齐墩果酸对照品2、4、6、8、10、15、20 μL进样，按上述色谱条件进行测定，以进样量 (X)为横坐标，峰面积 (Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程:Y=564220X－7190.5，(R2=0.9992)。结果表明齐墩果酸在0.3～3.0 μg范围内呈现良好的线性关系。

2.2.3 精密度实验 精密吸取同一齐墩果酸对照品溶液(0.15 mg/mL)10 μL，在2.2.2项条件下，重复进样5次，测定齐墩果酸的峰面积，计算得其RSD为1.60%。

2.2.4 重复性实验 精密吸取不同供试品溶液6份，在2.2.1项条件下进样10 μL，测定齐墩果酸的峰面积，计算得其RSD为1.72%。

2.2.5 稳定性实验 精密吸取供试品溶液10 μL，在2.2.1项条件下分别于0、2、4、8、12、24 h内测定齐墩果酸峰面积，计算得其RSD为1.36%。

2.2.6 加样回收率实验 精密称取不同供试品溶液6份，分别精密加入齐墩果酸对照品3 mg，在2.2.1项条件下测定齐墩果酸峰面积，计算得平均回收率为97.91%，RSD为0.84%，结果见表1。

表1 齐墩果酸加样回收率实验结果

2.3 酸水解工艺考察

2.3.1 酸水解合欢皮总皂苷的工艺研究 合欢皮皂苷为齐墩果酸型皂苷，常用水解剂有甲酸、乙酸、硫酸和盐酸等。本研究通过单因素实验考察乙酸、盐酸和硫酸的水解程度;以酸浓度、酸量、水解温度和酸解时间4个因素为考察对象，每个因素设立3个水平 (见表2)，采用L9(34)正交设计，以齐墩果酸含有量为指标，优选最佳的水解条件。

表2 L9(34)因素水平

2.3.2 单因素实验 按2.1.1项方法取0.2 g提取物于100 mL圆底烧瓶中，各加入30 mL 1 mol/L硫酸、30 mL 2 mol/L盐酸和30 mL 2 mol/L乙酸，85℃水浴锅中反应2 h。冷却后中速滤纸过滤，将沉淀用水洗至中性，收集滤液和洗液，沉淀放于烘箱中60℃烘干。用50 mL石油醚回流提取3次，每次提取2 h，合并提取液，旋干，加甲醇复溶，旋干，最后用甲醇定容至10 mL，制备供试品溶液。由结果可知硫酸水解后所得齐墩果酸含有量最高，合欢皮总皂苷水解的程度最佳，故所选酸为硫酸。

2.3.3 正交实验 取9份0.2 g提取物，按表3实验设计依次按照2.3.2项方法水解，制备供试品溶液。由表3可以看出，A、B、C、D对皂苷的水解影响程度不同，各因素的影响程度依次为:反应时间 (D)＞料液比 (B)＞酸的浓度 (A)＞反应温度 (C)，最佳的酸水解条件为A3B2C2D3，即加入3 mol/L硫酸30 mL，85℃反应4h。由于反应温度影响最小，在方差分析中将其作为误差。从方差分析结果表明，酸的浓度 (A)和料液比 (B)对结果影响不大，反应时间 (D)对结果有显著性影响，由于只有一个因素有显著性影响，因此本实验不考虑因素之间的交互作用，见表4。

表3 正交试验设计和结果

表4 方差分析

2.4 方法专属性和特异性考察

2.4.1 方法专属性考察 按上述色谱条件分别对对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进行分析。

精密吸取对照品溶液20 μL，按2.2.1项色谱条件进样，在WondaSilTMC18柱中的保留时间为7.8 min左右，说明在该HPLC色谱分析条件适宜，对供试品溶液的系统分离效果较好。

将原药水解后的水相，即水解液，按2.2.1项色谱条件进样，结果，在齐墩果酸的保留时间内不出峰，同时以齐墩果酸为对照品进行TLC检测亦无对应的斑点出现，说明水解液中不含齐墩果酸这一物质，而全部存在于水解后的固相内，即水解沉淀。

按2.2.1项色谱条件，将水解沉淀进行HPLC分析，结果，水解沉淀含有的成分过于复杂，在乙腈-水 (90∶10)条件下柱子分离齐墩果酸的效能大大降低，干扰了对齐墩果酸含有量的测定。但采用石油醚回流提取后，石油醚相的HPLC分析能在齐墩果酸保留时间内出峰，并有较好的峰形，理论塔板数不低于1000，说明石油醚回流提取基本能使齐墩果酸与其他物质达到分离的效果。

2.4.2 方法特异性考察 采用紫外分光光度法和HPLC法测定原药水解的水相溶液 (阴性对照溶液1)。HPLC法在检测原药水解后的水相溶液时，在齐墩果酸保留时间7.8 min左右无色谱峰，同时TLC检测时，在齐墩果酸对照品对应位置亦无紫色斑点出现，说明该样品无齐墩果酸这一化合物。而紫外分光光度法检测时有显色反应，且齐墩果酸质量分数达到40.36 mg/g(n=3，RSD为0.77%)。结果表明，HPLC法检测齐墩果酸这一化合物，专属性较强、准确性较好。

3 讨论

3.1 一种科学可行、灵敏特异的测定方法是评价药物组分有效物质含有量的重要工具。前期工作提取到的具有抗肿瘤新生血管生成组分，能较好抑制肿瘤内皮细胞的增殖和迁移能力，体内外评价其具有良好的成药性。为了控制提取工艺和促进其成药化，建立一个灵敏度高、专属性好和特异性好的方法具有非常的重要意义。

3.2 本实验建立了总皂苷的HPLC定量分析方法，且灵敏度高，测出最低含有量为0.3 μg;通过分别检测原药和阴性样品，原药水煮液中检测不到齐墩果酸，通过酸水解后，样品中能检测到齐墩果酸，说明其方法专属性好;采用紫外分光光度法测定合欢皮水解后的水相溶液，所得齐墩果酸质量分数达到38.04 mg/g，但是HPLC法检测时，在齐墩果酸保留时间7.8 min左右无色谱峰，同时TLC检测时，在齐墩果酸对照品对应位置亦无紫色斑点出现，说明该原药水解后的水相溶液中无齐墩果酸这一化合物，结果表明，HPLC法检测齐墩果酸这一化合物，特异性较好。

3.3 此方法关键步骤为酸水解工艺，本实验通过单因素实验和正交实验考察合欢皮总皂苷水解的主要因素并确定了最佳水解条件。实验结果表明反应温度对水解反应有显著影响。最佳水解总皂苷酸的种类为硫酸;其最佳水解工艺为:硫酸浓度3 mol/L，料液比1∶150，水解温度85℃，水解时间4 h。

3.4 本研究为合欢皮抗新生血管有效部位总皂苷的定量测定提供了一种可行的、灵敏性、特异性和重复性好的稳定的方法，为合欢皮抗新生血管有效部位的质量标准提高提供了科学依据。

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