人参花超微粉碎扫描电镜观察及人参皂苷测定

陈 斌， 赵伯涛*， 钱 骅， 赵亚南， 陈双林

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏南京210042;2.南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210046)

人参花为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey 的花，它在提神［1］、抗氧化［2］、增强免疫力［3］、神经保护［4］、抗癌［5］等诸多方面的保健效果目前已得到世界许多权威机构的认定，被称为“免疫保健的万能养生品”，人参皂苷是人参花中最重要活性成分，分析其组成与含有量对开发利用具有指导作用。

超微粉碎技术是近年来发展起来的一种粉碎新技术，广泛应用于中药材的加工，效果显著。由于超微粉碎使颗粒微细化导致表面积和孔隙率增加，细胞破壁，活性成分溶出速率和含有量提高［6］，因而能加强生物活性，提高中药的生物利用度。本实验对超微粉碎后的细胞形貌特征进行观察并与普通粉碎作对照，测定了超微粉和普通粉中总皂苷及单体人参皂苷。

1 材料

1.1 材料与试剂 人参花采自于吉林省长白县林业局参场，经南京师范大学生命科学学院龚祝南教授鉴定为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey的花。人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd对照品购于中国药品生物制品检定所。试剂:4%戊二醛、梯度乙醇、PBS(磷酸缓冲液)。

1.2 仪器与设备 FW100型高速粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;GQUS—300型气流粉碎机;JSM—5610LV型扫描电子显微镜;752紫外可见分光光度计 (上海菁华科技仪器有限公司);Aglient 1200液相色谱仪、四元泵、DAD检测器、Eclipse XDB-C18色谱柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm);超声波清洗机 (无锡雷士超声波设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 人参花超微粉与普通粉扫描电镜观察 将人参花样品普通粉碎 (过100目筛)和超微粉碎(过1000目筛)后，用4%的戊二醛固定3 h，用PBS(磷酸缓冲液)洗脱，最后用梯度乙醇脱水，并最终保持在70%乙醇中，常规临界点干燥后，用牙签将少量导电胶涂到样品台上。用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶上。粘贴后，待导电胶干透，真空镀膜后进行SEM镜检。

如图1和图2分别为普通粉和超微粉于500倍电镜扫描图，其中图1细胞结构完整很少有破损，图2细胞严重破损几乎看不到完整的细胞结构，图3和图4为1500倍下的电镜扫描图更加清晰说明普通粉碎细胞结构完整，而超微粉碎后细胞几乎完全破损。图5和图6为5000倍下的电镜扫描图，图5细胞表面结构清晰可见，而图6由于细胞破损严重表面凌乱。

2.2 分光光度法测定人参花超微粉和普通粉中总皂苷

2.2.1 人参花总皂苷的提取 分别精确称取人参花普通粉和超微粉各2.5 g，用水饱和的正丁醇溶液75 mL，在80 Hz超声振荡条件下，提取3次，每次0.5 h。合并3次提取液，减压回收正丁醇，残留物加甲醇溶解，最后定容至5 mL，得到0.5 g/mL人参花超声提取液。

图1 普通粉碎500x电镜扫描图Fig.1 The scanning image of ordinary powder at 500x electric mirror

图2 超微粉碎500x电镜扫描图Fig.2 The scanning image of ultrafine powder at 500x electric mirror

图3 普通粉碎1500x电镜扫描图Fig.3 The scanning image of ordinary powder at 1500x electric mirror

图4 超微粉碎1500x电镜扫描图Fig.4 The scanning image of ultrafine powder at 1500x electric mirror

图5 普通粉碎5000x电镜扫描图Fig.5 The scanning image of ordinary powder at 5000x electric mirror

图6 超微粉碎5000x电镜扫描图Fig.6 The scanning image of ultrafine powder at 5000x electric mirror

2.2.2 确定最大吸收波长 精密量取0.5 g/mL的普通粉和超微粉超声提取液各1 mL，用蒸馏水稀释至10 mL，得到0.05 g/mL的人参花提取液。分别精密量取0.05 g/mL的普通粉和超微粉提取液各50 μL，在60℃水浴中蒸发至干。加5%香草醛-冰醋酸溶液 (临用新配)0.2 mL，高氯酸0.8 mL，密塞于60℃水浴显色15 min后置冰浴中冷却，加冰醋酸5 mL，摇匀立即在400～700 nm波长下扫描，空白溶液作参比，确定最大吸收波长为538 nm。

2.2.3 标准曲线的制作 精密称取人参皂苷Re 5 mg，溶于10 mL量瓶中，制得0.5 mg/mL的标准液。分别量取 50、60、70、80、90、100 μL，按上述方法显色后于538 nm处测定吸光值，得线性方程为y=0.0024x－0.0956，R2=0.0993，线性范围在12 ～118 μg。

2.2.4 精密度试验 精密吸取0.5 mg/mL的人参皂苷Re对照品溶液60 μL 5份，按2.2.2项中的显色方法显色后测定吸收度，结果RSD为0.97%。

2.2.5 样品溶液稳定性和显色后溶液稳定性试验分别取普通粉和超微粉样品溶液放置，分别在0、1、2、3、4 h取样60 uL，平行取3管，按照线性实验方法显色后测定吸收度，计算，结果4 h内普通粉和超微粉都很稳定，RSD分别为1.17%和1.34% 。取普通粉和超微粉样品各60 μL，平行取三管，显色后放置，分别在0、1、2、3 h测定吸收度，计算，结果3 h内较稳定，RSD为2.27%。

2.2.6 重复性试验 取普通粉和超微粉样品溶液显色后，6次独立测定吸光度，结果普通粉中含总皂苷量为10.71%，RSD为1.56%，超微粉中含总皂苷量为13.97%，RSD为1.32%。

2.2.7 加样回收率试验 精密称取已知含总皂苷量的普通粉和超微粉各3份，分别加入一定量Re对照品，超声提取定容后各取60μL样品液，显色后测定吸收度，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率实验Tab.1 Recovery experiment

2.2.8 定量测定 称量普通粉和超微粉样品，按2.2.1项中的方法提取并定容，显色后6次独立测定吸光度，结果见表2。

表2 普通粉和超微粉中含总皂苷量(n=6)Tab.2 Content of total saponin in ordinary and ultrafine powder(n=6)

2.3 HPLC法测定人参花中人参皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd

2.3.1 标准曲线的制作 分别称取一定量的人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd对照品用甲醇溶于同一10 mL量瓶中制成混合对照品溶液用微孔滤膜过滤 (0.22 μm)。色谱条件:流动相为乙腈 (A)和水 (B)，梯度洗脱 (0～35 min，A为18.5%;35～55 min，A由18.5%升至29%;55～70 min，A由29%升至40%;70～80 min，A为40%)，柱温为20℃，于203 nm处测定峰面积制作标准曲线［7］。图 7 依次为人参皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd混合对照品溶液 (A)、普通粉碎人参花 (B)和超微粉碎人参花 (C)的HPLC图谱，表3为人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的标准曲线。

图7 人参皂苷混合对照品 (A)，普通粉 (B)及超微粉 (C)的HPLC图谱Fig.7 HPLC chromatograms of mixed reference substences(A)，ordinary powder(B)and ultrafine powder(C)

表 3 人参皂苷(Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd)的标准曲线Tab.3 The standard curves of ginsenoside(Rg1，Re，Rb1，Rc，Rd)

2.3.2 精密度试验 将2.3.1中的人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd对照品溶液分别等量进样6次，测定峰面积，其 RSD分别为0.96%、0.33%、0.85%、0.73%、0.48%。

2.3.3 重复性试验 平行5次测定普通粉和超微粉中单体人参皂苷，结果见表4。

2.3.4 加样回收率试验 精密称取已知各单体皂苷含有量的普通粉和超微粉各3份，分别加入一定量含5种皂苷的混合标准品超声提取后定容，采用2.3.1中的色谱条件并于203 nm处测定峰面积，代入标准曲线中计算出各单体人参皂苷的含量计算回收率，结果见表5。

表4 重复性实验结果(n=5)Tab.4 Results of reproducible experiment(n=5)

表5 普通粉和超微粉中各单体人参皂苷的加样回收率试验(n=3)Tab.5 Recovery experiment of each ginsenoside in ultrafine and ordinary powder(n=3)

2.3.5 定量测定 另取普通粉和超微粉超声提取后定容，采用2.3.1项中的色谱条件梯度洗脱并于203 nm处测定峰面积，代入标准曲线中计算出各单体人参皂苷的含有量，平行测定5次比较普通和超微粉碎人参花中各单体人参皂苷溶出率，结果见表6。

表6 超微粉和普通粉中各人参皂苷的含有量(±s，n=5)Tab.6 Contents of each ginsenoside in ultrafine and ordinary powder(±s，n=5)

表6 超微粉和普通粉中各人参皂苷的含有量(±s，n=5)Tab.6 Contents of each ginsenoside in ultrafine and ordinary powder(±s，n=5)

人参皂苷质量分数/(mg·g－1)Rc Rd超微粉 9.11±0.38 59.73±0.47 11.52±0.53 12.87±0.14 Rg1 Re Rb1 27.45±0.25普通粉 6.37±0.29 44.79±0.41 8.20±0.39 9.38±0.45 19.48±0.18

3 讨论

人参花扫描电镜显示普通粉碎人参花被分散成很多组织块，在提取的过程中细胞中的人参皂苷需透过多层细胞膜才能到达细胞外，且由于细胞结构的存在渗透平衡始终存在，很难将细胞中的人参皂苷完全提取出来。而超微粉碎后的人参花不存在多层细胞结构且细胞结构完全破裂，人参皂苷无需透过细胞膜便可溶解在提取溶剂中。分别对普通粉及超微粉进行总皂苷及人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd的测定，结果与普通粉相比超微粉总皂苷的溶出率提高约 30%，而人参皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd的溶出率也显著的提高。

人参中的主要活性成分为人参皂苷，《中国药典》2010年版规定人参中人参皂苷Rg1、Re含有量不得低于0.3%，Rb1不得低于0.2%，而人参花尤其经超微粉碎后的人参花这3种皂苷的含有量是上述标准的数倍乃至数十倍，并且其中Re、Rd的含有量较高且各种皂苷的组成和比例与人参中的差异较大。以人参皂苷Re为例超微粉碎后的人参花约为人参中的10倍，而Re已确认对二型糖尿病及其并发症有显著作用，Re可以降低二型糖尿病小鼠的空腹血糖，提高其糖代谢的能力并可以降低小鼠眼球、肾及主动脉细胞中MDA的水平同时还原型谷胱甘肽的水平有明显提高［8］。可以明显降低糖尿病小鼠血浆中C－反应蛋白的水平，对糖尿病小鼠有一定的抗炎作用，可以缓解糖尿病后期的并发症［9］。此外，Rb1能促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取［10］，Rc能促进肌肉细胞对葡萄糖的摄取［11］，Rc已证明对心脑血管、神经系统、免疫系统等作用独特，在镇痛和神经保护等作用方面其作用也要大于其他人参皂苷［12］。因此，超微粉碎后的人参花可能在糖尿病、神经性疾病等药物或保健产品的开发中发挥重要作用。

［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］:上海:上海科学技术出版社，1996:1269-1300.

［2］黄俊明，李立文，杨国光，等.人参花蕾提取物对大鼠生化指标及细胞凋亡的影响［J］.毒理学，2005，19(3):323.

［3］鲍 涛，杨贵贞.人参花中皂苷对小鼠某些免疫学效应及其机理探讨［J］.中西医结合，1984，4(3):172-175.

［4］张树臣.人参不同部位中人参皂甙的药理作用［J］.中成药研究，1980(5):35-37.

［5］王本祥，刘爱晶，崔景朝.人参茎叶和花皂甙抗肿瘤作用的研究［J］.中成药，1989(2):27-29.

［6］赵伯涛，钱 骅，徐德然，等.超微冻干人参的粉体特征皂苷测定及功效研究［J］.中草药，2008，39(3):380-382.

［7］国家药典委员会会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:8.

［8］Cho W C，Chung W S，Lee S K W，et al.Ginsenoside Re of Panax ginseng possesses significant antioxidant and antihyperlipidemic efficacies in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2006，12(9):173-179.

［9］Cho W C，Chung W S，Yip T T，et al.Altered expression of serum protein in ginsenoside re-treated diabetic rats detected by SELDI-TOF MS［J］. Ethnopharmalogy， 2006，12(5):272-279.

［10］Shang Wenbin，Yang Ying，Zhou Libin，et al.Ginsenoside Rb1stimulates glucose uptake through insulin-like signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes［J］.Endocrinology，2008，12(8):561-569.

［11］Lee M S，Hwang J T，Kim S H，et al.Ginsenoside Rc，an active component of Panax ginseng，stimulates glucose uptake in C2C12 myotubes through AMPK-dependent mechanism［J］.Ethnopharmacology，2010，12(11):771-776.

［12］周超群，周 珮.人参皂苷Rd的研究进展.［J］.中草药，2009，5:832-836.