培养条件对罗布麻愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷积累的影响

王 芳， 计巧灵， 邓 倩， 李玉薇

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

罗布麻Apocynum venetum Linn隶属夹竹桃科Apocynaceae罗布麻属，是一种多年生草本植物，又名野麻、红麻、茶叶花，我国主要分布在新疆、青海、甘肃、陕西、河南等省区［1］。罗布麻全草入药已千年，分别被载入2005、2010年版的《中国药典》之中［2-3］。罗布麻叶含有黄酮类化合物、生物碱、酚类、强心苷、氨基酸和微量元素［4-5］，其中黄酮类化合物在罗布麻的药用成分中占很大比例［6］，主要包括芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等［7-8］，据报道，金丝桃苷、异槲皮苷在镇痛、保护心肌、保肝、抗氧化方面有重要作用［9-12］。然而，由于罗布麻生境、气候环境等条件不断恶化，致使资源越来越匮乏，不宜大规模开发利用，限制了罗布麻这一重要资源的开发。因此，利用组织培养技术，研究以罗布麻愈伤组织为材，生产金丝桃苷、异槲皮苷等重要的次生代谢药效成分具有重要的现实意义。目前，关于运用罗布麻组织培养技术生产药用成分的研究，除了本实验室以罗布麻愈伤组织为材产绿原酸［13］外，在国内外未见其他报道。本实验探讨了培养条件对罗布麻愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷积累的影响，以期为提高罗布麻愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷的含有量提供科学依据。

1 仪器、材料与方法

1.1 仪器与试剂 LC-10A高效液相色谱仪 (日本岛津公司)(LC-10ATVP泵，SPD-10AVP紫外检测器，CTO-10AVP柱温箱，2010化学工作站);0.22 μm微孔纤维素滤膜;KQ2200DB型数控超声波清洗器;SORVALL Pico and Fresco微型离心机;电子天平 (型号 AL104，METTLER TOLEDO);PYX-DHS-40X50-B型隔水式电热恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂);实验室常规仪器设备。金丝桃苷对照品 (批号:20110311)，异槲皮苷对照品(批号:20110619)均购于上海源叶生物科技有限公司;甲醇 (色谱纯);乙腈 (色谱纯);磷酸(优级纯);超纯水。

1.2 材料 罗布麻种子采自新疆精河县，罗布麻子叶来源的愈伤组织由本实验室提供，愈伤组织培养温度为 (25±2)℃，光照周期为16 h/d，光强度为2500 lx。愈伤组织分别培养在不同条件的培养基，收集的愈伤组织在培养箱中30℃干燥至恒定质量，粉碎过40目筛，得粗粉备用。

1.3 色谱条件 C18-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm);柱温25℃;检测波长360 nm;体积流量0.6 mL/min;进样量20 μL;流动相见表1。

表1 梯度洗脱流动相Tab.1 Mobile-phase of gradient elution

1.4 愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的测定

1.4.1 愈伤组织生长率的测定 每个处理接种3瓶，每瓶接种愈伤组织5块 (约0.5 g)，愈伤组织生长25 d后，取出每瓶中的愈伤组织称定质量。愈伤组织生长率=(收获时的愈伤组织湿重-接种时的愈伤组织湿重)/接种量，实验重复3次，取平均值。

1.4.2 金丝桃苷和异槲皮苷的测定 精确称取粗粉0.10 g，准确加入80% 甲醇1.0 mL，于40℃，60 W，超声提取40 min，12000 r/min离心5 min，取上清，过0.22 μm滤膜，即得供试品溶液。按上述色谱条件测定金丝桃苷和异槲皮苷。

1.5 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷、异槲皮苷对照品各20 mg，分别加80%甲醇100 mL溶解，制成质量浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。

1.6 线性关系考察 分别取上述金丝桃苷、异槲皮苷对照品溶液 0.5、2.5、5、7.5、10 mL，用80%甲醇定容至10 mL，按照上述色谱条件取20 μL进样进行测定，以峰面积与质量浓度 (x)绘制工作曲线，得金丝桃苷回归方程为y=752.76x－2.6927，R2=0.9996;异槲皮苷回归方程为y=728.32x－2.58297，R2=0.9998，结果在0.01～0.20 mg/mL范围内，线性关系良好。

1.7 罗布麻叶中金丝桃苷和异槲皮苷

1.7.1 精密度试验 分别精密吸取上述两种对照品溶液20 μL，连续进样5次，测定峰面积，计算，得金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为1.4%、1.2%，表明精密度良好。

1.7.2 稳定性试验 取同一供试品，分别于0、1、2、4、8、12、14、16 h进样，测定峰面积，计算，得金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为1.0%、0.9%，表明样品在16 h内稳定。

1.7.3 重复性试验 取同一个供试品共5份，按1.4.2项制备，测定，金丝桃苷、异槲皮苷的峰面积的平均值分别为4091366.2、6163213.1，RSD分别为1.1%、1.3%，表明重复性良好。

1.7.4 加样回收试验 取同一个样品共12份，其中6份用于测定本底值，另外6份中分别添加一定量的金丝桃苷和异槲皮苷对照品，进行测定，结果金丝桃苷平均回收率98.34%，RSD为1.6%;异槲皮苷平均回收率97.58%，RSD为1.3%，说明该方法适合分析罗布麻愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷。

1.7.5 样品测定 精确称取罗布麻叶粉0.1 g，按1.4.2项提取，经HPLC检测，8月份野生罗布麻叶中金丝桃苷、异槲皮苷质量分数分别为6.02 mg/g、7.14 mg/g。

1.8 实验设计

1.8.1 测定8月份野生罗布麻叶片中金丝桃苷和异槲皮苷，操作同1.7.5项。

1.8.2 将多份相近质量的愈伤组织分别接种在含不同激素配比的培养基上，培养25 d，探讨愈伤组织产金丝桃苷、异槲皮苷的最佳激素配比 (见表2)。

表2 培养基不同激素配比对愈伤组织产金丝桃苷、异槲皮苷的影响Tab.2 Effects of media with the different matching of hormone on hyperinand and isoquercitrin contents in callus of Apocynum venetum L.*

1.8.3 将称定质量的多份愈伤组织分别接种在含不同蔗糖、葡萄糖浓度的最佳激素配比的培养基上，培养25 d，探讨碳源对愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响 (见表3)。

1.8.4 将称定质量的多份愈伤组织分别接种在含不同浓度的NH4NO3和KNO3、而含最佳碳源、激素配比的培养基上，培养25 d，探讨氮源对愈伤组 织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响 (见表4)。

表3 碳源对愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响Tab.3 Effects of carbon source on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

表4 氮源对愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响Tab.4 Effects of nitrogen source on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

1.8.5 将称重的多份愈伤组织分别接种在添加不同浓度NaCl而含最佳氮源、碳源、激素配比的培养基上，培养25 d，探讨NaCl浓度对愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响 (见表5)。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比的培养基对罗布麻愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷积累的影响 由表2可见，当培养基附加0.5 mg/L KT和0.5 mg/L NAA时，愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含有量均最高，分别达到6.12 mg/g和7.23 mg/g;在4种激素组合中，KT和NAA组合最有利于愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷的积累;适量浓度的KT与NAA，6-BA与NAA组合较有利于愈伤组织生长。

2.2 培养基碳源对罗布麻愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响 由表3可知，培养基的碳源为20g/L蔗糖+20g/L葡糖糖时，愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷含有量均达最高，分别为14.89倍和7.45 mg/g、8.69 mg/g;培养基以蔗糖为碳源较有利于愈伤组织的生长;培养基不同碳源对愈伤组织的生长率和金丝桃苷、异槲皮苷积累有较大影响。

表5 不同浓度NaCl对愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响Tab.5 Effects of different NaCl concentrations on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

2.3 培养基氮源对罗布麻愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响 由表4可知，当培养基含1650 mg/L NH4NO3+1900 mg/L KNO3时愈伤组织生长率最大，为13.74倍，金丝桃苷和异槲皮苷含有量分别达到7.71 mg/g和8.99 mg/g;当培养基中含2475 mg/L NH4NO3+2850 mg/L KNO3或3300 mg/L NH4NO3+3800 mg/L KNO3时，愈伤组织褐化严重，部分死亡;当培养基含2475 mg/L NH4NO3时，愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含有量均达最大值，分别为8.67 mg/g、9.86 mg/g，生长率为7.95倍，可见氮源对愈伤组织的生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的积累有较大影响。

2.4 不同浓度NaCl对罗布麻愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷的影响 由表5可知，当培养基中NaCl浓度为25 mmol/L时，愈伤组织生长率最大，为13.36倍;随着NaCl浓度增加，生长率逐渐减小，当NaCl浓度为500 mmol/L时，愈伤组织严重褐化，部分死亡。当培养基中NaCl浓度为150 mmol/L时，愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含有量最高，分别为10.07 mg/g、11.15 mg/g;当NaCl浓度为300 mmol/L时，这两种成分的含有量分别为8.09 mg/g、9.17 mg/g，可见，适量浓度NaCl能促进愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷的积累。

3 讨论

本实验培养基中添加不同激素配比对细胞中次生代谢产物的积累有一定影响，这与文献［14-15］报道的一致，培养基中添加不同配比的激素，愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含有量不同，附加0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA时，愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含有量最高，说明植物生长调节剂是影响植物次生代谢物质积累的一个因素。

糖是培养基必需的碳源，既提供能量，也对维持渗透压起重要作用，通过探究不同碳源对愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含有量的影响，发现碳源为2.0 mg/L蔗糖+2.0 mg/L葡糖糖时，愈伤组织的生长率和金丝桃苷、异槲皮苷含有量均达最高，但碳源为5.0 mg/L时，愈伤组织生长和次生代谢物积累均受到抑制，可能是糖浓度过高，致使培养基渗透压提高，不利于细胞被动吸收营养，进而影响愈伤组织生长和次生代谢物积累。

氮源也是培养基中不可缺少的养分，氮元素含有量的减少往往刺激次生代谢物质的产量增加［16］，本实验发现，培养基中氮源单独使用NH4NO3或KNO3时，浓度过高、过低均不利于愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷的积累;同时使用两种氮源时，较单独使用利于金丝桃苷和异槲皮苷的积累，但是浓度过高会使细胞褐化死亡;培养基添加常规MS培养基氮源时，愈伤组织生长率最大;若仅考虑金丝桃苷和异槲皮苷的含有量，2475 mg/L NH4NO3为最佳氮源。

实验发现，培养基中NaCl浓度为25 mmol/L时，愈伤组织生长率最大，培养基中NaCl浓度为150 mmol/L时，愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含量最高，但是当NaCl为500 mmol/L时，愈伤组织褐化死亡;说明NaCl对愈伤组织中次生代谢产物的积累起一定的作用，可能是因为罗布麻是一种耐盐植物，其细胞对一定浓度的盐离子有耐受性。有关培养基中NaCl对植物次生代谢产物积累的影响尚未见报道。

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