大鼠全脑缺血再灌注损伤后硫酸镁及胞二磷胆碱的脑保护作用

西安市中心医院神经内科（西安710003） 董亚茹 由凤秋 杨 震

缺血后神经保护剂的应用，已在脑缺血损伤治疗上起到了重要的作用。联合治疗因其能应用不同神经保护剂对缺血再灌注损伤后引起的瀑布式级联反应的不同路径起到阻止或延缓作用，而有很好的应用前景。我们通过对联合应用硫酸镁及胞二磷胆碱治疗全脑缺血再灌注大鼠的研究，观察缺血再灌注后大鼠神经行为及海马神经元Bcl－2表达的变化，探讨其治疗效果。

材料及方法

1 材 料 兔抗鼠Bcl－2抗体及SABC免疫试剂盒；SD大鼠，280～320g，雄性，60只（西安交通大学实验动物中心提供）。随机分为：缺血组、硫酸镁组、胞二磷组、联合组，每组又分为1、3、7日组。动物单笼饲养，自由进食饮水。另外选2只大鼠不进行模型制作，作为正常对照组。

2 方 法 ①模型制作：采用改良的四血管阻塞法［1］制成大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠经10%水合氯醛（350 mg/kg体重）腹腔注射后，俯位固定于立体定位仪上，头向下屈曲30度暴露锥间隙后，于颈后第一、二颈椎处，切一长约2c m切口，分离颈部的肌肉，暴露第一颈椎上的双侧翼孔，插入双极电凝器，烧凝其中走行的椎动脉，清洁、缝合伤口，置笼喂养。禁食，自由饮水。24h后同法麻醉动物，仰卧位固定后分离颈部肌肉，暴露双侧颈总动脉，动脉夹夹闭30 min后实现再灌注。假手术组仅暴露双侧翼孔及颈总动脉，各血管不行闭塞。观察各组大鼠的意识、瞳孔、角膜反射、翻正反射等变化，并做记录。模型成功标准［2］：双侧颈动脉夹闭后1 min内动物意识丧失；眼球变白，双侧瞳孔散大，对光反射消失；翻正反射消失。不符和上述标准者或再灌流期间出现全身强直、抽搐等异常发应者排除实验。②治疗方案：缺血结束后再灌注开始时即用药，硫酸镁组：硫酸镁90 mg/kg腹腔注射；胞二磷胆碱组：胞二磷胆碱250 mg/kg腹腔注射；联合组：硫酸镁、胞二磷胆碱同上剂量腹腔注射，正常对照组及缺血组腹腔内注射生理盐水1．5 ml，依次于同时间连续注射1、3、7日。③取材及制作标本：依各时间段在麻醉状态下开胸经左心室至主动脉插管，先用温热生理盐水快速灌注300 ml左右，再以4%多聚甲醛灌注前固定，先快后慢，在开始的5 min灌注约200 ml，再根据动物肢体变硬状况调整流速，使总灌注时间保证在30 min左右，然后断头取脑，于乳头体及视交叉平面行冠状切开，制成包含背侧海马的约4 mm厚的脑片，后固定48h后常规石蜡包埋、切片（厚约5μm）干燥。④HE染色：切片脱蜡至水苏木素染5～10 min，盐酸酒精分色后伊红染3～5 min，脱水后封片、观察。⑤Bcl－2免疫组化染色：干燥切片脱蜡至水，置入枸橼酸钠缓冲液（p H6．0）行微波抗原修复10 min，冲洗后滴加30g/L H2O2阻断内源性酶15 min，冲洗5 min，分别滴加Bcl－2抗体10μl，4℃孵育过夜，PBS冲洗后，参照SABC试剂盒说明分别滴加二抗及SABC、DAB显色液，脱水后封片、观察。⑥神经行为功能的观察：利用美国弗尼吉亚大学颅脑损伤研究中心提供的评分方法检测［3］。各组动物均在手术前3d进行行走训练，并于缺血前1h测定其基础值，缺血后连续测定，每组动物分别测两次。行走实验：观察大鼠在宽2．5c m，长30c m的木条上行走情况，记录通过所需时间。

3 统计学处理 采用SPSS统计软件进行多组均数的方差分析和t检验。

结 果

1 HE染色 光镜下，正常海马CA1区神经细胞数量多，排列整齐，核圆形，核仁清晰。凋亡细胞表现为细胞散在，细胞体积缩小，核固缩，染色质浓染或边聚。硫酸镁组、胞二磷胆碱组及联合组与缺血组比较凋亡细胞减少，其中联合组较其他组凋亡细胞明显减少。

2 Bcl－2蛋白染色 Bcl－2蛋白染色阳性细胞表现为胞质染色棕黄色，颗粒状分布，胞核不着色，细胞体积正常。正常海马区未见染色阳性细胞。缺血再灌注24h，Bcl－2明显表达，硫酸镁组、胞二磷胆碱组及联合组与缺血组相比较明显增加（P＜0．05）。缺血再灌注3d时阳性细胞较多，其中联合组与其他组相比阳性细胞数目有明显差异（P＜0．05）。缺血再灌注7d后阳性细胞逐渐减少，但联合组阳性细胞与其他组比较仍有显著统计学差异（P＜0．01）。见表1。

表1 缺血再灌注后1、3、7d各组Bcl－2阳性细胞数比较（，个/每视野）

表1 缺血再灌注后1、3、7d各组Bcl－2阳性细胞数比较（，个/每视野）

注：与缺血组相比较＊P＜0．05，△P＜0．01

组 别 1d 3d 7d缺血组 12．0±1．4 9．8±1．9 6．3±1．4胞二磷胆碱组 13．5±1．5＊ 12．0±2．4＊ 9．0±1．9＊硫酸镁组 18．0±1．7＊ 14．9±1．3＊ 10．0±2．0＊联合组 25．1±1．6＊△ 21．3±1．8＊△ 16．9±1．6＊△

3 神经行为功能观察 缺血组行走实验明显迟缓于其他组（P＜0．01），联合组肢体恢复与单一用药组比较有明显差异（P＜0．01），硫酸镁组与胞二磷胆碱组比较无明显差异。见表2。

表2 缺血再灌注后1、3、7d各组行走功能比较（，s/个）

表2 缺血再灌注后1、3、7d各组行走功能比较（，s/个）

注：与缺血组比较＊P＜0．05，△P＜0．01

组 别 缺血前 再灌注后1d 再灌注后3d 再灌注后7d缺血组 3．67±0．79 20．00±2．10 23．90±1．58 28．20±0．75胞二磷胆碱组 3．60±1．02 7．20±1．72＊ 8．20±1．33＊ 10．20±2．14＊硫酸镁组 3．67±1．01 6．80±1．33＊ 7．60±1．02＊ 9．20±1．33＊联合组 3．60±1．08 5．40±1．02＊△ 6．40±1．02＊△ 8．40±1．50＊△

讨 论

研究［4］证实，细胞凋亡是脑缺血过程中神经元损失的一种形式。细胞凋亡是通过合成某些新的蛋白质而实现的，而Bcl－2家族蛋白的调控是其中之一重要机制。研究显示，低水平的Bcl－2 mRNA广泛分布于发育中和成熟的大鼠脑中，Bcl－2基础表达减少则易导致某些细胞死亡。Bcl－2是重要的抑制神经元的凋亡的蛋白，在缺血后注定要存活的神经元中表达。也有研究表明，脑缺血再灌注后24h海马区的Bcl－2蛋白表达才明显上升，启动相应的保护机制。本研究发现联合治疗组大鼠凋亡神经元数目与其他组相比明显减少，说明联合应用硫酸镁及胞二磷胆碱抑制缺血再灌注后神经元凋亡，减轻神经功能缺损，对缺血损伤有明显的治疗作用。

硫酸镁的神经保护作用的研究主要为局灶性脑缺血的预防及治疗方面［5－6］。镁离子能够阻断由钙超载引起的细胞损伤途径，从而保护细胞线粒体的结构和功能、降低血脑屏障通透性、减轻脑水肿、缩小梗死体积［7－8］。本研究表明给予不同周期硫酸镁均可有效减轻脑神经细胞病理损害、增加Bcl－2蛋白表达，并促进大鼠行为功能恢复。胞二磷胆碱参与体内磷脂酰胆碱的合成，有改善脑代谢作用，并可减轻脑水肿，刺激神经生长，还可恢复脑缺血后损害的膜结构的完整性。研究［9］认为胞二磷胆碱的脑保护作用与抑制脑缺血诱导的谷氨酸浓度升高、阻止缺血所致ATP水平下降、稳定细胞膜、抑制自由脂肪酸的释放和减少自由基的产生有关。本研究表明其与缺血组比较有明显统计学差异，与硫酸镁组比较无明显统计学差异。而联合组与其他各组比较均有统计学差异，说明联合治疗可优于各单一药物治疗，能更显著改善脑神经功能恢复。

脑缺血缺氧的联合治疗目的是获得完全的功能恢复及组织学正常的大脑。临床实践发现，除了具有多种治疗效应的钙离子通道阻滞剂有轻度益处外，各种单一的药物治疗均不能对神经功能预后产生良好的效应。因此，需要对进一步联合治疗进行积极评价。细胞膜稳定剂胞二磷胆碱及NMDA拮抗剂镁的联合使用可作用于级联反应的不同方面，并减少药物剂量，降低不良反应发生率，对缺血脑组织将有明显的保护作用。

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