紫外分光光度法测定发酵液中胞二磷胆碱钠含量

陈天来，彭奇均

(江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡 214122)

胞二磷胆碱钠(CDPC)是卵磷脂生物合成的重要前体，对于改善脑组织代谢，促进大脑功能恢复和促进苏醒有较好的疗效，其在临床上常用于急性颅脑外伤和脑手术后的意识障碍［1］。

目前，主要采用生物发酵法合成胞二磷胆碱钠［2］。生物发酵合成胞二磷胆碱钠时，在对发酵液进行灭活和固液分离后，发酵液中除胞二磷胆碱钠外还常含有蛋白质等物质，常采用离子交换树脂吸附分离其中的杂质以纯化胞二磷胆碱钠［2-5］。

胞二磷胆碱钠的主要检测方法有:HPLC法［6-7］、紫外分光光度法［8-10］。HPLC 法操作复杂，分析条件较为苛刻，不利于发酵、分离过程中胞二磷胆碱钠的快速检测;紫外分光光度法具有快速、简便、易于操作等优点。

紫外分光光度法需将胞二磷胆碱钠配制成含0.1 mol/L盐酸的溶液，在280 nm的波长下测定其吸光度，而采用离子交换树脂分离纯化胞二磷胆碱钠的过程中伴随着溶液pH的变化，在不能确定溶液pH的情况下传统的紫外分光光度法不适用于胞二磷胆碱钠分离纯化过程中的分析。

虽然传统的紫外分光光度法并不适用于分离纯化过程中胞二磷胆碱钠的分析，但可通过改进使其能分析任意pH溶液中的胞二磷胆碱钠含量。本文基于紫外分光光度法，以有别于传统紫外分光光度法在280 nm下分析，选择不受溶液 pH影响的265 nm波长为检测波长作为改进方向，同时研究了不同操作温度、蛋白质浓度等因素对该方法的影响。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

胞二磷胆碱钠标准品、胞二磷胆碱钠发酵液均由苏州天马医药集团提供;盐酸、氢氧化钠均为分析纯;牛白蛋白，生物试剂。

TU1901双光束紫外可见分光光度计(带恒温水浴装置);pH S-25型pH计;EL204电子分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 不同pH的胞二磷胆碱钠溶液 以盐酸及氢氧化钠为溶质，配制 pH 值分别为 0，2，4，10，12，14的溶液。精密称取胞二磷胆碱钠标准品500 mg于烧杯中，加入去离子水溶解并定容于100 mL容量瓶中。

分别准确移取胞二磷胆碱钠溶液6，10，16，20，24，30 mL于100 mL容量瓶中，分别加入10 mL不同pH溶液，定容至刻度线。最终使浓度分别为30，50，80，100，120，150 μg/mL 的不同浓度的胞二磷胆碱钠溶液均有 pH 分别为 2，4，6，8，10，12 的胞二磷胆碱钠溶液。

1.2.2 含不同浓度牛白蛋白的胞二磷胆碱钠溶液(含胞二磷胆碱钠2.5 mg/mL) 精密称取2.500 g的胞二磷胆碱钠分别以浓度为 50，75，100，125，150μg/mL的牛白蛋白溶液溶解并定容于100 mL容量瓶。

1.2.3 胞二磷胆碱钠标准液(0.5 mg/mL) 精密称取胞二磷胆碱钠标准品50 mg，加入去离子水溶解后定量转移至100 mL容量瓶中定容，得胞二磷胆碱钠标准液。

1.3 标准曲线的绘制

分别精密量取 1，2，4，6，8，10，12，16，20，30 mL的胞二磷胆碱钠标准液至100 mL容量瓶中，并用去离子水定容，测定其在265 nm波长下的吸光度。以胞二磷胆碱钠浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，见图1。

图1 胞二磷胆碱钠浓度与吸光度的关系Fig.1 Absorbance curve of CDPC in different pH

由图1可知，胞二磷胆碱钠溶液在0～150μg/mL的浓度范围内线性良好，拟合直线方程为 A=0.014 3C+0.001 9，线性相关系数 R2=0.999 7。

2 结果与讨论

2.1 溶液p H对胞二磷胆碱钠吸光度的影响

以去离子水为参比，不同pH的胞二磷胆碱钠溶液在210～360 nm扫描结果见图2。

图2 不同浓度胞二磷胆碱钠溶液在不同pH下的光谱扫描曲线Fig.2 Absorbance curve of CDPC in different pH

由图2可知:①胞二磷胆碱钠浓度30～150 g/mL范围内，随pH增大，胞二磷胆碱钠溶液的最大吸收波长减小;当pH＞6时，胞二磷胆碱钠吸光度光谱扫描曲线在210～360 nm的范围内基本重合，pH对胞二磷胆碱钠吸光度的测量无影响;②在30～150 g/mL的浓度范围内，相同浓度下，不同pH的胞二磷胆碱钠溶液的光谱扫描曲线均相交于同一点，即在265 nm波长处不同pH的胞二磷胆碱钠溶液吸光度均相同，即265 nm下胞二磷胆碱钠吸光度与pH大小无关，故选择265 nm作为胞二磷胆碱钠的检测波长。

2.2 蛋白质的干扰

将含不同浓度牛白蛋白的胞二磷胆碱钠溶液稀释100倍后，以去离子水为参比液，测定其在265 nm波长下的吸光度。结果胞二磷胆碱钠及蛋白质在紫外光区的吸收区间几乎重叠，即在265 nm的波长下蛋白质可能会对胞二磷胆碱钠分析测定产生干扰。

经分析，胞二磷胆碱钠发酵液中蛋白质含量约为94μg/mL，故配制蛋白质浓度分别为 0～150μg/mL且含25 mg/mL胞二磷胆碱钠混合溶液，测定其265 nm波长下的吸光度，结果见图3。

图3 蛋白质浓度对胞二磷胆碱钠含量分析的影响Fig.3 Absorbance curve of CDPC in different pH

由图3可知，在265 nm波长测定得到吸光度的波动＜1.5%，表明蛋白质对该方法分析胞二磷胆碱钠浓度影响小，可忽略不计。

2.3 测定温度的影响

分别精密量取 2，4，8，12，16，20 mL 的胞二磷胆碱钠标准液至100 mL容量瓶中，并用去离子水定容，分别在10，15，20，25，30 ℃的恒温条件下测定其在265 nm波长下的吸光度，结果见图4。

图4 胞二磷胆碱钠溶液吸光度与温度的关系Fig.4 Absorbance curve of CDPC in different pH

由图4可知，在10～30℃的范围内胞二磷胆碱钠溶液在265 nm下的吸光度呈现水平，说明吸光度不受温度的影响，故可在10～30℃的范围内的任意温度下测定胞二磷胆碱钠浓度。

2.4 方法的精密度及加标回收率

2.4.1 精密度 重复测定同一样品在265 nm的吸光度，结果见表1。

表1 精密度实验结果Table1 Precision experimental result

由表1可知，方法的相对标准偏差为0.178%，表明方法精密度较高。

2.4.2 加标回收率 吸取10 mL浓度为30μg/mL的胞二磷胆碱钠溶液8份，分别加入10 mL浓度为40，50μg/mL的胞二磷胆碱钠溶液混合均匀，测定其吸光度，结果见表2。

表2 加标回收率Table2 Recovery of standard addition

由表2可知，各样品的加标回收率均＞95%，说明该方法具有较高的准确度。

3 结论

以265 nm作为检测波长，建立了胞二磷胆碱钠的紫外吸收分析法，此波长下胞二磷胆碱钠吸光度不受溶液pH影响。由于发酵液中蛋白质含量小，对胞二磷胆碱钠分析影响可忽略，并且此方法在10～30℃的范围内不影响胞二磷胆碱钠分析。

胞二磷胆碱钠浓度在一定范围内与吸光度呈线性相关，其线性回归方程为A=0.014 3C+0.001 9，线性相关系数 R2=0.999 7，线性范围为 5～100μg/mL，相对标准偏差为0.178%，平均加标回收率为100.87%，重现性好。本法测定操作简便、准确，适用于发酵液中胞二磷胆碱钠含量的测定。

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［2］ 侯立向，赵晜.胞二磷胆碱的发酵合成及其纯化［J］.生物化学与生物物理进展，1979(5):40-48.

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［4］ 苏州天马医药集团.胞磷胆碱钠的制备方法:CN，194461A［P］.2007-04-11.

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