樱桃叶多糖的抗氧化活性研究

刘德胜，刘为忠，颜 玲

(1.滨州医学院 药学院，山东 烟台 264003;2.中国海洋大学，山东 青岛 266003)

樱桃叶，收录于《中华本草》，为蔷薇科植物樱桃(Prunus pseudocerasus Lindl.)的叶片，味辛苦、性温、无毒，具有温胃、健脾、止血、解毒的功效，还能降压、治胃寒食积、腹泻、吐血、疮毒等［1］。樱桃叶中含有黄酮［2］、挥发油［3］等。目前对樱桃叶多糖(PPP)的药理作用方面的研究尚未见报道。在前期研究中，我们对樱桃叶中的多糖进行了定性鉴别和含量测定。本文对樱桃叶提取水溶性多糖的体外抗氧化活性进行了研究。

1 材料

樱桃叶采自山东烟台，经滨州医学院中西医结合学院刘孟安教授鉴定为蔷薇科植物、品种为大红灯樱桃的叶片。

丙二醛(MDA)测试盒和总蛋白定量测试盒(BCA法)，南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(纯度＞96%)，阿拉丁试剂公司。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器责任有限公司;RE-52-05旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;台式高速冷冻离心机，Biofuge Primo。

SD大鼠，雄性，220 g左右，山东绿叶制药有限公司提供，动物合格证号:SYXK(鲁)20030020。

2 方法与结果

2.1 PPP的制备与含量测定

樱桃叶烘干粉碎后，用石油醚和乙醇脱色、脱杂后，风干，粉末用水(1∶40)加热浸提，静置离心，浓缩至原体积30%，浓缩液加入4倍体积的95%乙醇沉淀，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮及乙醚洗涤，用水复溶，透析，Sevag法除蛋白，真空干燥灰白色PPP;用硫酸-蒽酮法测定多糖含量为53.7%。

2.2 总还原能力的测定

将 PPP 配成多糖浓度为 40.0，80.0，120.0，160.0，200.0 μg/mL 的溶液，同时采用相同浓度的Vc作为对照。采用文献方法［4］，准确吸取不同浓度的样品液1.0 mL，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.6)2.5 mL，1.0%K3［Fe(CN)6］溶液 2.5 mL，50℃水浴30 min，急速冷却后加入10.0%三氯醋酸2.5 mL，混合后加入 0.3%FeCl3溶液 0.5 mL，混匀后，于700 nm波长处测吸光度(A)值，每个浓度平行做3管，取平均值。观察在实验浓度范围内，PPP浓度和A值之间的关系。一般情况下，物质的还原能力越强，其抗氧化活性也越高。根据本方法，各个样品反应后的生成物在700 nm处的A值大小即反映了其抗氧化能力的大小。随着PPP浓度的增加，A值也随之增大，说明在实验浓度范围内，PPP总还原能力随着浓度的增大而增大;与Vc相比，PPP的总还原能力稍弱。结果见图1。

图1 樱桃叶多糖总还原能力测定图(λ=700 nm)Fig.1 Total reducing power of PPP(λ =700 nm)

采用邻苯三酚自氧化法［6］测定PPP对的清除能力。加0.05 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.2)4.5 mL于试管中，置25℃水浴20 min。加入不同浓度(40.0，80.0，120.0，160.0，200.0 μg/mL)的 PPP 溶液或者Vc溶液0.4 mL和25℃的邻苯三酚溶液(10 mmol/L HCl溶液配制)80 μL，加入后快速摇匀，测定在325 nm波长处的A值，每隔0.5 min记录1次，连续记录4 min，计算各管的氧化速率及对的清除率。实验浓度范围内，随着PPP浓度的增大，其清除的能力也随之增高，PPP浓度为200.0 μg/mL 时，清除率达到 23.5%;PPP 对的IC50为991.4 μg/mL，同等条件下 Vc 的 IC50为281.9 μg/mL;说明 PPP 对的清除能力较强，但弱于同等浓度下的Vc清除能力。结果见图3。

2.3 对羟自由基(·OH)的清除作用

采用Fenton法［5］测定 PPP对·OH的清除作用。在10 mL试管中加入9.0 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9.0 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL、不同浓度(40.0，80.0，120.0，160.0，200.0 μg/mL)的 PPP 溶液1 mL，最后加入8.8 mol/L H2O21 mL启动反应;以水作为空白对照，在波长510 nm处测定各浓度样品的A值。每个浓度的样品重复测定3次取平均值。随着PPP浓度的增大，其清除·OH的能力随之增强，PPP浓度为200.0 μg/mL时，清除率能达到77.6%;PPP 对·OH 的 IC50值为 100.5 μg/mL，相同条件下 Vc对·OH的IC50值为41.9 μg/mL。说明PPP对·OH的清除能力较强，但弱于同等浓度下的Vc。结果见图2。

图2 樱桃叶多糖清除·OH能力图Fig.2 Scavenging effects of PPP on ·OH free radicals at different concentrations

2.4 对超氧负离子()的清除能力

图3 樱桃叶多糖对的清除能力Fig.3 Scavenging effects of PPP onfree radicals at different concentrations

2.5 对有机自由基(DPPH·)的清除能力

用无水乙醇作为溶剂，将DPPH配制成浓度为40 μg/mL 的溶液，PPP 配制成浓度为 50.0，100.0，200.0，250.0 和 300.0 μg/mL 的系列溶液，用相同浓度的Vc作为对照。每次取待测溶液2 mL与预先配制好的40 μg/mL DPPH溶液2 mL在25℃下反应30 min后，测定其525 nm波长处的A值［7］。

实验浓度范围内，随着PPP浓度的增大，其清除DPPH·的能力也随之增高，浓度为300.0 μg/mL时，清除率能达到74.4%;PPP对DPPH·的IC50值为 135.1 μg/mL，同等条件下 Vc 的 IC50为 20.9 μg/mL;低浓度下清除能力远小于同等浓度下的Vc清除能力，在高浓度下和Vc清除能力相差不大。结果见图4。

图4 樱桃叶多糖对有机自由基的清除能力图Fig.4 Scavenging effects of PPP on DPPHo free radicals at different concentrations

2.6 PPP对大鼠肝自发性脂质过氧化的影响［8］

在0～4℃下，SD大鼠脱颈椎处死，于肝门静脉注射生理盐水至肝脏变为土黄色，迅速取肝脏，匀浆后，3 000 r/min离心10 min，取上清液备用，使用蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。用生理盐水制成100 g/L的组织匀浆。PPP及 Vc浓度分别为1.0，1.5，2.0，2.5 和 3.0 mg/mL。每个浓度平行 3 管，每管加组织匀浆0.5 mL，不同浓度 PPP溶液0.1 mL，混匀。37℃温育2 h，按照试剂盒要求及说明操作，测定MDA含量，并计算抑制率。

结果(图5)表明，随着PPP浓度增大，其抑制大鼠肝脏自发性脂质过氧化所产生的MDA能力也随之增强，PPP浓度为3.0 mg/mL时，抑制率能达到90.4%;PPP 该作用的 IC50值为 1.5 mg/mL，相同条件下Vc的IC50为0.9 mg/mL;与相同浓度的Vc相比，其抑制能力稍弱。

2.7 PPP对 H2O2诱导大鼠肝脂质过氧化的影响［8］

同2.6项下制备100 g/L的大鼠肝脏组织匀浆。先在各管中加入100 g/L肝匀浆0.5 mL，各浓度(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL)PPP 或 Vc 溶液0.1 mL，37℃温育振荡反应15 min，再向各管中加入 100 mmol/L H2O20.1 mL，继续温育反应30 min，各管中加入200 g/L三氯乙酸1.5 mL终止反应，以10 000 r/min离心10 min，取上清液，加入617 g/L 2-硫代巴比妥酸溶液1.5 mL，并置沸水中15 min。同2.6项下测定MDA含量，并计算抑制率。

图5 樱桃叶多糖对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响Fig.5 Effect of PPP on MDA generation spontaneously in liver of rats

结果(图6)表明，随着PPP浓度的增大，其抑制大鼠由H2O2诱导的肝脏脂质过氧化能力也随之增强，PPP浓度为3.0 mg/mL时，抑制率达到86.5%，PPP该作用的IC50值为0.9 mg/mL，相同条件下Vc的IC50值为0.5 mg/mL;和同等浓度的Vc相比，其抑制大鼠肝脏由H2O2诱导产生的MDA效果稍弱。

图6 樱桃叶多糖对大鼠肝匀浆诱导性脂质过氧化的影响Fig.6 Effect of PPP on MDA generation induced by H2O2in liver of rats

3 讨论

植物来源的多糖类化合物拥有免疫调节、抗肿瘤活性以及降血糖、降血脂活性和抗氧化等的独特功能，而且大多数毒性较小，在预防疾病上优于其他化合物，因此其应用具有广阔的前景［9］。本研究了PPP的体外抗氧化活性，结果表明，PPP对自由基的清除能力依次为·OH＞DPPH·，并远远超过对的清除率，对大鼠肝脏自发性和由H2O2诱导的产生的MAD也均有较强抑制能力;但弱于同等浓度下的Vc抗氧化能力，说明PPP对不同类型自由基的清除能力不同。樱桃是烟台地区特产，樱桃叶来源廉价而广泛，本实验研究结果可为进一步开发、应用樱桃叶这一传统中药提供依据。

［1］国家中医药管理局，《中华本草》编委会.中华本草［M］.第四册(第十卷).上海:上海科学技术出版社，1998:2586.

［2］张 杰，焦淑清，滕 杨，等.樱桃叶中总黄酮的提取工艺研究［J］.黑龙江医药科学，2010，33(2):13-14.

［3］孙艳丽，钱文涛，赵春生，等.甜樱桃叶片中挥发油成分分析［J］.西北农林科技大学学报:自然科学版，2002，30(4):76-78.

［4］曹 炜，卢 珂，陈卫军，等.不同种类蜂蜜抗氧化活性的研究［J］.食品科学，2005，26(8):352.

［5］伍 钢，彭密军，彭 胜.柑橘不同部位提取物对羟自由基的清除作用研究［J］.食品科学，2009，30(23):41-43.

［6］韩少华，朱靖博，王妍妍.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究［J］.中国酿造，2009(6):155-157.

［7］陈 颖，周 岩，曹银萍，等.天花粉总皂苷的提取及其清除DPPH自由基作用的研究［J］.药物生物技术，2010，17(5):397-399.

［8］李 晓，冯 雷，胡尊丽，等.马齿苋多糖的抗氧化活性研究［J］.中国生化药物杂志，2010，31(4):244-246.

［9］陈 旋，张 翼，张剑波.植物多糖的研究进展［J］.中国中药杂志，2007，16(13):1000-1004.