他克莫司对截肢创伤应激后大鼠肺线粒体损伤的保护作用

张海峰，张 颖，任青爱，谢晓华

（解放军总医院 南楼外一科，北京 100853）

当机体受到严重创伤、手术、休克等打击时，会产生一系列应激反应，导致机体损伤，肺脏、心脏等远隔脏器的损害常较为严重。研究发现[1]：大鼠截肢创伤可造成肺损伤，术后6h肺损伤最重。研究已证实：缺血缺氧是导致各种脏器损害的主要始动因素之一，线粒体损害是缺血缺氧损害的关键环节，创伤引起的缺血缺氧等原因导致线粒体结构和功能的损伤可能是创伤后肺脏等远隔脏器损害的重要环节。本实验旨在研究截肢创伤后大鼠肺组织细胞内线粒体结构与功能的损伤情况及他克莫司（tacrolimus，FK506）对其的干预及作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

生物氧耗分析系统（Strathkelvin，英国）、多功能酶标仪 SynergyHT（Bio-TEK，美国）；荧光分光光度计 Hitachi-2500（日立，日本）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒 （碧云天生物技术研究所）；总ATP酶活力测定试剂盒 （南京建成生物工程研究所）；Rhodamine 123、ADP（Sigma，美国）。

1.2 实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠24只，体重260～300g，购自第三军医大学实验动物中心，常规条件下标准饲料喂养。随机分为3组（n=8）。对照组：腹腔注射与干预组等体积的生理盐水，6h后麻醉迅速处死；创伤组：以截肢创伤应激后6h大鼠作为创伤对照，创伤后立即腹腔注射与干预组等体积的生理盐水，截肢术后6h迅速处死；干预组：截肢后立即腹腔注射FK506 0.1mg/kg[2]，截肢术后6h迅速处死。

1.3 动物模型制作及标本采集

3%异戊巴比妥钠（80mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定。先于左侧腹股沟处切开皮肤，游离出股动静脉，结扎腹壁浅动静脉及其他分支，于膝关节上方1.2～1.4cm处完全切断除股静、动脉以外的所有结构，缝扎止血，最后剪断股静、动脉，建立大鼠左后肢的截肢创伤应激模型。6h后将大鼠断头处死，立即解剖取出肺脏。取肺脏组织约1g，置于带冰碴生理盐水中清洗残存血液，参照STE溶液分离法[3]提取分离肺脏线粒体：按1g组织+9ml分离介质比例加入0～4℃的线粒体分离介质 （250ml反应体系中加入蔗糖 21.935g、Tris 0.3025g、EDTA 0.073g， 用 Tris-HCl调节 pH 至7.5），组织剪碎后匀浆、离心、取上清，收集的上清液于2℃下11500g离心15min，弃上清，用适量（2～3ml）分离介质悬浮，重复离心 1次，最后将沉淀用分离介质悬浮制成线粒体混悬液。以上操作均在0～4℃下进行，1h内完成。

1.4 指标检测

1.4.1 线粒体呼吸功能测定

采用strathkelvin氧电极法测定线粒体呼吸功能，测定参照卢国守等[4]的方法。总反应体积为800μl，反应温度30℃。 预先加入 700μl反应介质（甘 露 醇 225mmol/L、 蔗 糖 75mmol/L、KH2PO45mmol/L、Tris 10mmol/L、K+-EDTA 0.05mmol/L、KCl 5mmol/L，pH7.4）孵育 2min，以空气饱和，然后加入线粒体悬液100μl，预温1～2min后依次加入反应底物谷氨酸钠 （1.25mol/L）和苹果酸钠（1.25mol/L） 各 10μl， 间 隔 约 1min， 后 加 入40mmol/L的ADP 2μl，观察线粒体呼吸态的变化，记录氧耗曲线，计算在ADP加入后3态呼吸（ST3）和 ADP耗尽后 4态呼吸（ST4）的氧耗量，呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）以 3、4 态耗氧之比（ST3/ST4）表示。

1.4.2 线粒体膜电位测定

按Ronald等[5]的方法进行。反应介质为蔗糖150mmol/L、氯化镁 5mmol/L、琥珀酸钠 5mmol/L、鱼滕酮2.5mmol/L、磷酸钾缓冲液5mmol/L、Rhodamine123 1μmol/L、Hepes 20mmol/L，pH7.4。取线粒体悬液100μl，加反应介质1ml，室温下反应5min，然后5000g离心5min，取上清于500nm处比色测线粒体外Rhodamine123浓度（Xout）。设定线粒体基质体积1μl/mg蛋白，线粒体内Rhodamine123 浓度 Xin=（1-1.1×Xout）×10000/蛋白浓度，线粒体膜电位 MMP=59×lgXin/Xout。

1.4.3 线粒体总ATP酶活力测定

ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的含量可判断ATP酶活性的高低。定义每小时每毫克组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为 1个 ATP酶活力单位［μmolPi/（mgprot·h）］。 严格按照 ATP 酶试剂盒说明书操作。

1.5 电镜观察

从创伤组、干预组中随机留取1只大鼠肺组织约1mm×1mm×1mm，立即置于 2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）中4℃固定1～2h，PBS洗3次，反复换液，1%锇酸固定。送电镜室浸润包埋，制作超薄切片，透射电子显微镜下观察并拍照。

1.6 统计学方法

采用SPSS15软件进行方差齐性检验、成组资料采用t检验。

2 结果

2.1 肺线粒体呼吸功能的变化

与对照组比较，创伤组肺线粒体ST3耗氧量、RCR、膜电位及总ATP酶活力显著降低 （P＜0.05），ST4耗氧量有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与创伤组比较，干预组线粒体ST3耗氧量、RCR、膜电位及总ATP酶活力显著升高（P＜0.05），ST4耗氧量有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05） （表 1）。

表1 各组大鼠肺线粒体呼吸功能指标的变化（±s，n=8）

表1 各组大鼠肺线粒体呼吸功能指标的变化（±s，n=8）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与创伤组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 电镜观察

创伤后6h肺线粒体膜结构不清晰，线粒体明显肿胀，部分线粒体出现空泡、嵴减少、断裂、结构不清（图1A）。加用FK506后肺线粒体肿胀及内部结构损伤见轻度肿胀，程度比创伤组有所减轻（图 1B）。

图1 大鼠肺细胞线粒体形态的透射电镜观察

3 讨论

线粒体对于维持细胞的正常功能具有十分重要的作用。研究表明，线粒体功能异常是细胞损害的关键环节[6]。线粒体呼吸功能ST3代表ADP对线粒体氧化磷酸化功能的刺激效应，ST4反映质子漏状况，RCR反映线粒体结构完整性及氧化磷酸化耦联程度；而线粒体膜电位直接反映线粒体功能[7]，线粒体其正常功能依赖于膜结构的高度完整性，线粒体能量代谢障碍会引起膜电位的下降[8]。ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，线粒体膜上的ATP酶是调节和维持细胞和线粒体钙稳态的关键因素。

本实验结果显示：截肢创伤导致了大鼠肺线粒体结构和功能的损伤，这可能是创伤后肺损害的重要环节。这一变化可能的机制是：①氧自由基生成过量。氧自由基能够影响线粒体呼吸链复合物的活力，其生成过量可通过影响线粒体的氧化磷酸化而降低细胞内ATP的合成[9]。②Ca2+超载。当Ca2+摄入过量时，促使内膜小孔开放，引起线粒体膜电位降低和氧化磷酸化的脱耦联[10]。在心肌细胞和神经细胞的研究中显示[11，12]：缺血后由于线粒体能量代谢障碍，导致线粒体发生肿胀；同时线粒体细胞质内Ca2+的重摄取能力下降，导致线粒体呼吸功能障碍。③线粒体通透性转换孔的高通透状态即所谓的线粒体通透性转换（mitochondrial permeability transition，MPT）， 它与细胞死亡调节有关。当发生MPT时，线粒体允许分子量＜5000Da的物质自由进出，Ca2+全部释放，膜电位完全、永久消失，线粒体肿胀，它受Ca2+、ADP、氧化应激及高PH诱导[10]。

钙调蛋白（CaN）介导的信号通路参与血管平滑肌细胞增殖和内皮细胞功能的调节，在细胞凋亡的调节中也起重要作用。Sayen等[13]发现在CaN转基因小鼠模型中，CaN信号通路影响了心肌线粒体的能量代谢。另有研究发现：CaN抑制剂FK506预处理可以保护心肌、肝、肾受损线粒体的呼吸功能[14，15]。本实验结果提示FK506的应用可使肺线粒体功能明显改善，说明CaN信号通路可能参与了截肢创伤应激后的肺线粒体损伤，FK506干预可部分改善肺线粒体的呼吸功能，对创伤应激后肺线粒体损伤具有保护作用。环孢素A （Cyclosporin A，CsA）是经典的通透性转换孔（MPTP）抑制药，可与亲环蛋白 D（CyP-D）结合形成复合物，阻碍CyP-D与ANT的结合、抑制通道开放[16]。FK506是CsA的换代产品，可能通过相似机制抑制了通道的开放、发挥膜电位稳定作用。

总之，截肢创伤可能通过炎性反应、缺血、缺氧、Ca2+超载等途径和机制导致肺线粒体出现结构和功能的损伤，而FK506可能通过抑制CaN信号通路、稳定线粒体膜、提高线粒体氧化磷酸化耦联程度、在一定程度上缓解能量供应的不足，减轻创伤后肺细胞线粒体的损伤，从而为进一步研究创伤后肺损伤的保护提供了实验依据。

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