养阴柔肝活血法对大鼠酒精性肝纤维化肝星状细胞PDGF 及其受体表达的影响

赵鲲鹏

本实验旨在探讨养阴柔肝活血法与活化的肝星状细胞分泌的PDGF及其受体PDGFR的相关性，进而阐明其抗酒精性肝纤维化的作用机制。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠60只，体重200±20g，购自甘肃中医学院实验动物中心。

1.1.2 实验药品和主要试剂 养阴柔肝活血法方药制剂由甘肃中医学院附属医院制剂室根据配方制作而成;白酒(乙醇)为北京酿酒总厂出品的56度红星牌二锅头白酒;橄榄油由上海中秦化学试剂有限公司提供;鳖甲煎丸为武汉中联药业集团股份有限公司产品，国药准字z42020772;吡唑为新沂市汇力精细化工有限公司产品;高脂饲料由北京科澳协力饲料有限公司根据配方(87.5%基础饲料+2%胆固醇+10%猪油+0.5%胆盐)生产;PDGF_BB及PDGFR_β试剂盒由西安科昊生物工程有限责任公司提供;四氯化碳由烟台市双双化工有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 造模方法与分组处理 首先制备“乙醇-橄榄油-吡唑”混悬液［60%酒精8ml/(kg·d)］、橄榄油2ml/(kg·d)、吡唑25mg/(kg·d)］，CCl4橄榄油注射液(CCl4∶橄榄油=1∶3);对大鼠进行混悬液灌胃，并间断饲高脂饲料，结合微量CCl4腹腔注射的复合模式造酒精性肝纤维化病理模型，造模方法参照文献［1］并略加改进。60只Wistar雄性大鼠适应性喂养3天后随机分为6组，即正常组10只，造模组50只。①正常组:大鼠普通喂养，生理盐水灌胃10ml/(kg·d)×12周;第2周起予以0.3 ml/kg剂量的生理盐水腹腔注射，每周2次，至第8周末结束。②造模组大鼠酒精混悬液灌胃，第1周6ml/(kg·d)，第 2周 8ml/(kg·d)，第 3 周 10ml/(kg·d)，以后维持此量，直至造模8周末结束。另外第2周起按0.3ml/(kg·d)剂量腹腔注射微量CCl4橄榄油溶液，2次/周，至第8周末结束;同时隔周间断性饲喂高脂饲料。③第8周末造模组50只大鼠随机分为5组，即模型组、鳖甲煎丸治疗组、养阴柔肝活血法高、中、低剂量治疗组，每组10只。④各治疗组于造模8周后给药，1次/日，每天同一时间灌胃，连续4周，分别根据大鼠具体体重确定药量(按体重换算)，每(3～4)日称体重后调整剂量。

养阴柔肝活血方药物制备方法:麦冬15g，当归15g，柴胡12g，白芍 10g，枳实 10g，栀子 10g，枳椇子 10g，黄芪 12g，炙鳖甲10g，丹参12g，苍术10g，白寇10g，茯苓15g。每剂药头煎加水500ml，煮取300ml;二煎加水300ml，煮取200ml;两煎相合，去渣再煎至400ml。所有药物均购自甘肃中医学院附属医院中药房，由甘肃中医学院附属医院制剂室研究室加工成中药浸膏(每克浸膏相当于生药3.28g)，4℃贮存备用，用前按比例生理盐水稀释。

用药剂量:参考人的临床用量确定小、中、大3个灌胃给药剂量。养阴柔肝活血方中药浸膏(3.28g)，人临床生药量1g/(kg·d)，人临床生药量的5倍即为大鼠灌胃量的中剂量［5g/(kg·d)］，经计算调养阴柔肝活血方大鼠灌胃中剂量为1.5g/(kg·d)中药浸膏，小剂量为0.75g/(kg·d)中药浸膏，大剂量为3.0g/(kg·d)中药浸膏，相当于人临床给药量的5倍，2.5倍，10倍，中药对照药(鳖甲煎丸)灌胃给药量为0.25g/(kg·d)，相当于人的临床用量的5倍，模型组予生理盐水10ml/(kg·d)灌胃，治疗时间为4周。

1.2.2 收集标本 实验第12周末，均于末次给药后24小时，禁食12小时，动物断颈处死。统一留取大鼠肝左叶组织，加入一定量的PBS(pH7.4)，冰浴中制成肝组织匀浆。离心3000转/分×20分钟。收集上清液，分装待测。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 大鼠PDGF检测方法 严格按照大鼠PDGF检测试剂盒说明书要求操作。具体操作步骤如下:①提前20分钟将试剂盒取出放置在室温下。②从已平衡至室温的密封袋中取出板条。③标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔14孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl分别加到第十一、第十二孔中，再在第十一、第十二孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第十一、第十二孔中分别取50μl加到第十三、第十四孔中，再在第十三、第十四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第十三、第十四孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为36ng/L，24ng/L，12ng/L，6ng/L，3ng/L，1.5ng/L，0.75ng/L)。④加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后将所有实验组大鼠肝组织匀浆液加入到相应的孔中，每孔加入10μl，轻轻晃动混匀。⑤温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。⑥ 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。⑦洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。⑧加酶:每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。⑨温育:操作同3。⑩洗涤:操作同5。⑪ 显色:每孔先加入显色剂 A 50μl，再加入显色剂 B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。⑫ 终止:每孔加终止液50μl，终止反应。⑬测定:以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。⑭标准品制定标准曲线，根据标准曲线获得每只大鼠肝组织匀浆液中具体的PDGF浓度。

1.2.3.2 大鼠PDGFR检测方法 具体操作如大鼠PDGF检测步骤，只是标准品的稀释与加样后，浓度分别为1200ng/L，800ng/L，400ng/L，200ng/L，100ng/L，50ng/L，25ng/L。

2.结果

养阴柔肝活血法对酒精性肝纤维化大鼠肝脏HSC中PDGF及PDGFR相对浓度的影响，见表1。

实验结果显示，模型组PDGF及PDGFR平均浓度显著高于正常组及养阴柔肝活血法高、中剂量组，差异有极显著统计学意义(P＜0.001);鳖甲煎丸组、养阴柔肝活血法低剂量组PDGF及PDGFR平均浓度均显著低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05);养阴柔肝活血法中剂量组PDGF及PDGFR平均浓度明显低于鳖甲煎丸组，差异有统计学意义(P＜0.05);养阴柔肝活血法高、低剂量组与鳖甲煎丸组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);养阴柔肝活血法中剂量组降低PDGF及PDGFR的效果优于高、低剂量组。

表1 各组PDGF及PDGFR的平均浓度

3.讨论

PDGF是目前已知的HSC最强的促分裂素，以激活HSC并促进其增殖、转化为主，也可促进其产生胶原［2］。PDGF必须与细胞膜上的相应受体结合后才能发挥其生物学效应，PDGF受体由两种亚单位α及β构成，激活的HSC才表达β亚单位［3］。国内外研究者普遍认为PDGF-BB及PDGFR-β在肝纤维化过程中的作用尤为突出。故了解PDGF及PDGFR在酒精性肝病的发生发展中的表达变化，将有助于解释酒精性肝纤维化的发病机制及中药治疗该病的疗效机理。基于以上理论，我们选取PDGF及PDGFR研究对象，通过探索养阴柔肝活血法抑制肝纤维化形成过程中PDGF及PDGFR的变化，以期为养阴柔肝活血法的靶向作用提供理论依据。结果显示PDGF及PDGFR在各治疗组的表达较模型组减少，且均有显著性差异。提示降低PDGF及PDGFR在肝组织中的表达，从而抑制HSC的激活、增殖以及细胞外基质的合成，可能是养阴柔肝活血法发挥抗肝纤维化作用机制之一。

1 杨华，张丽军，冯艳玲，彭秀华，周文江.酒精复合性肝纤维化大鼠模型的建立及动态观察［J］.实验动物与比较医学，2008，28(4):234-237.

2 LI RONG，ZHAO MENYUN.Effects of Astragalus herb soup on expression of TGF- β1，CTGF and PDGF-BB in experimental hepatic fibrotic rats［J］.Proceeding of clinical medicine，2006，15(9):659-661.

3 Wong L，Yamasaki G，Johnson RJ，Friedman SL.Induction of betaplatelet-derived growth factor receptor in rat hepatic lipocytes during cellular activation in vivo and in culture.J Clin Invest 1994;94:1563-1569.