胎盘型钙黏蛋白在寻常性银屑病患者血清和皮损中的表达及意义

李高峰，袁皓琛

银屑病皮损组织病理学上表现为角化不全和角化过度，角质形成细胞（KC）高度增生。KC间主要连接形式为桥粒和半桥粒连接，这种连接方式是由相邻细胞的细胞膜发生卵圆形致密增厚而共同构成，而胞膜间隙之间重要的黏附分子胎盘型钙黏蛋白（P-cad）是表皮连接结构中重要的黏附蛋白。P-cad介导同种细胞间的黏附反应，并通过一些信号传导途径导致胞内转录和翻译的变化，参与细胞黏附和信号传导过程，可引起细胞过度增生[1]。本研究分别采用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化法检测血清和皮损中P-cad的表达，探讨P-cad在寻常性银屑病发病中的作用及其与疾病严重程度的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 选择2010年1～12月在扬州市第一人民医院和苏北人民医院皮肤科确诊为寻常性银屑病患者40例，其中进行期16例，稳定期15例，消退期9例；男22，女18，平均年龄（35.78±15.62）岁（17～62岁）；健康对照40名，健康对照血清来自两所医院皮肤科医师、学生和实习生以及正常体检者，其中男26名，女14名，平均年龄（33.26±11.35）岁（20～53岁）。对照组正常皮肤来自两所医院整形美容患者切除下的正常皮肤。排除标准：患有红斑狼疮、天疱疮、皮肌炎、风湿性关节炎等自身免疫性疾病，以及其他严重的系统性疾病，且在3个月内曾使用过大剂量免疫抑制剂和糖皮质激素等影响免疫功能的药物。对照组排除以上标准外尚需排除银屑病。本实验经本院伦理委员会通过，研究对象均签署知情同意书。患者组和健康对照组在年龄、性别等方面差异无统计学意义（P＞0.05）。对患者的银屑病皮损严重程度指数（PASI）进行评分。

1.1.2 主要试剂 人P-cad双抗体夹心ELISA试剂盒、兔抗人P-cad（胎盘型钙黏蛋白）、即用型SABC检测试剂盒（羊抗兔）均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 抽取患者及对照者外周静脉血3 ml处理并保存。皮损取材：银屑病患者选择具有代表性的典型的原发皮损取材（患者组与对照组均取自上肢）。

1.2.2 皮损中P-cad检测 皮损中P-cad检测按所购试剂盒说明进行，①轮转切片机切片，并常规脱蜡至水。②30%H2O21份+蒸馏水10份混合灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。③热修复抗原：将切片浸入0.01 mmol/L 枸橼酸盐缓冲液，加热至沸腾，冷却后PBS缓冲液洗涤1～2 次。④滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。⑤滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜，PBS缓冲液洗2 min，共3次。⑥滴加生物素化兔抗IgG，20～37 ℃ 20 min。PBS缓冲液（pH7.2～7.6）洗2 min，共3次。⑦滴加试剂SABC，20～37 ℃ 20 min。PBS洗5 min，共4次。⑧DAB显色。⑨ 苏木精轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。

1.2.3 结果判定标准 阳性染色定位于细胞膜或细胞间连接处，并出现黄色或棕黄色的细小颗粒着色为阳性细胞。光镜下于KC阳性染色处随机选择5个视野，采用双评分方法：①根据染色强度评分：无显色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②根据阳性细胞所占的百分率评分：≤25%为 0分，26%～ 50%为 1分，51%～ 75%为 2分，＞75%为3分。将上述两项所得积分相加，1～2分判为“+”，3～4分判为“++”，5～ 6分判为“+++”，“++”和“+++”视为阳性表达。

1.2.4 血清中P-cad检测 采用双抗体夹心ELISA法，试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，操作步骤按试剂盒说明进行。

1.3 统计学方法

应用 SPSS13.0统计软件进行分析，分析数据用均值±标准差（±s）表示；血清中P-cad表达组间差异采用t检验进行分析；正常皮肤与寻常性银屑病皮损P-cad表达阳性率的差异采用χ²检验，皮损表达强度与PASI评分的相关性采用Spearman等级相关检验分析。P＜0.05认为差异有显著性，P＜0.01认为差异有极显著性。

2 结果

2.1 寻常性银屑病患者血清中P-cad的表达

P-cad在40例患者和40名对照者血清中均有表达，寻常性银屑病组表达为（14.27±7.85）μg/L ，而正常对照组为（4.78±3.31）μg/L，P-cad在寻常性银屑病组血清中的表达水平显著高于正常对照组，组间差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 寻常性银屑病患者血清中P-cad表达水平与PASI评分的相关性

40例寻常性银屑病患者血清P-cad的表达水平与PASI评分（Pearson相关系数值）r=0.820，P ＜0.01，两者呈正向线性相关（图1）。

2.3 P-cad在寻常性银屑病患者皮损中的表达

2.3.1 表达定位 健康对照组P-cad表达定位在表皮基底层细胞膜或细胞间连接处，棘层可见极少量表达，均呈棕黄色颗粒状，呈不连续表达；患者组P-cad表达除在基底层有棕黄色颗粒沉积外，棘层、颗粒层均有表达，各层表达数量、强弱不等（图2，3）。2.3.2 表达百分率 对照组和患者组表皮基底层P-cad表达阳性率均为100%，棘层及以上阳性率分别为4.64%和80.92%，患者组显著高于对照组（χ²=30.34，P ＜ 0.01）（表 1）。

图2 P-cad在正常对照者皮肤中的表达

图3 P-cad在寻常性银屑病患者皮损中的表达

表1 P-cad在银屑病患者和正常对照者皮损中的表达 （例）

2.4 寻常性银屑病患者皮损中P-cad表达与PASI评分的相关性

12 例寻常性银屑病患者PASI 评分的值越高，其皮损P-cad表达强度越高。采用 Spearman等级相关检验分析显示，12例寻常性银屑病患者皮损中P-cad表达强度与 PASI评分呈正相关（r=0.615，P＜0.05）（图 4）。

3 讨论

钙黏蛋白是细胞间连接的重要结构蛋白，是一类钙离子依赖型跨膜黏附分子。至今已发现并证实的钙黏蛋白超家族已超过80种，包括经典钙黏蛋白，桥粒钙黏蛋白等。经典钙黏蛋白含有723～748个氨基酸，主要分为P-cad、E-cad和N-cad三大类[2]。

P-cad位于细胞边缘，特别是细胞-细胞连接区域，通过附着蛋白与胞内蛋白结合，相邻细胞中蛋白丝束通过P-cad和附着蛋白编织成了一个广泛的网络，将相邻细胞连接在一起。王永贤等[3]和杨井等[4]研究发现，P-cad在正常人主要表达于基底层，表达微弱且不连续，其他层中未见表达；而银屑病皮损中P-cad在表皮全层均有强表达，且两者表达的阳性率差异有统计学意义，这与笔者的研究结果基本一致。Tinkle 等[5]和Eunkyung等[6]研究发现，通过动物实验靶向去除小鼠表皮E-cad，结果P-cad在基底层反应性表达增加，推测银屑病皮损处E-cad受损，P-cad表达上调是对E-cad受损起到部分代偿作用，而正是这种部分代偿导致上皮分化和增生的改变。另有研究表明，E-cad表达未发生变化，P-cad在银屑病皮损中的表达显著增强，表达模式从正常的基底层变为表皮全层[7]，认为银屑病皮损中P-cad的这种表达模式和强度的改变可能与银屑病表皮KC的延迟分化和过度增殖有关。

本研究对皮损中P-cad的检测结果显示，寻常性银屑病患者皮损处P-cad在表皮细胞中的表达明显高于对照组，推测P-cad可能与KC细胞的增殖有着重要的联系。皮损部位P-cad表达增加，通过细胞间的连接体系及细胞内外的信号传导系统，造成细胞生物学行为的变化，引起基底层和棘层这两类表皮增生及细胞增殖周期的改变，最终导致KC细胞的增殖过度。本研究结果显示，寻常性银屑病患者血清中P-cad表达水平明显高于正常对照组，且血清中P-cad的表达水平与患者的病情严重程度呈正相关，表明P-cad可能参与了寻常性银屑病的发生。推测患者血清中P-cad表达水平的升高可能与银屑病患者表皮过度增生，表皮细胞凋亡速度加快，引起蛋白质的分解增加，造成P-cad大量释放入血液而升高有关；也可能被某些酶分解或者其他机制破坏后进入血液循环，导致血清中P-cad水平升高。

P-cad是表皮细胞间连接结构中的重要黏附分子，对表皮形态和功能的维持起着重要的作用。本研究发现其在寻常性银屑病患者血清和皮损中的表达出现异常，说明其与寻常性银屑病的发病存在着联系，但具体机制尚不清楚，还有待今后进一步的深入研究。

[1]Angst B, Marcozzi C, Magee A. The cadherin superfamily:diversity in form and function [J]. J Cell Sci, 2001, 114 (4):629-641.

[2]Albelda SM. Role of integrins and other cell adhesion molecules in tumor progression and metastasis [J]. Lab Invest, 1993,68(1):4-9.

[3]王永贤, 李政霄, 彭振辉. E-钙黏素、P-钙黏素在进行期银屑病皮损中的检测 [J]. 中国皮肤性病学杂志, 2007,21(1):24-25,40.

[4]杨井, 涂亚庭. E-钙黏素、P-钙黏素在寻常型银屑病皮损中的表达及其意义 [J]. 中国麻风皮肤病杂志, 2005, 21(5):343-345.

[5]Tinkle CL, LechlerT, Pasolli HA, et al. Conditional targeting of E-cadherin in skin:insights into hypeproliferative and degenerative responses [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101(2):552-557.

[6]Eunkyung C, Pau WC, Charles AP, et al. Amphiregulin causes function down regulation of adherens junctions in psoriasis [J]. J Invest Dermatol, 2005, 124(6):1134-1140.

[7]Zhou S, Matsuyoshi N, Takeuchi T, et al. Reciprocal altered expression of T-cadherin and P-cadherin in psoriasis vulgaris [J].Br J Dermatol, 2003, 149(2):168-173.