丁苯酞对血管性痴呆大鼠认知功能及海马区Aβ表达的影响

窦 雯 杜业亮 刘 英 李增芬

1）潍坊医学院 潍坊 261042 2）山东潍坊市脑科医院神经内科 潍坊 261021

随着我国进入老龄化社会，脑血管病人逐年增加，血管性痴呆血管性痴呆（VaD）人数也在不断增长，导致患者记忆、认知功能障碍，给家庭和社会带来沉重的负担。VaD是由血管性因素导致脑组织损害引起的痴呆，为老年期痴呆中仅次于阿尔茨海默病的第二位常见的类型［1］。探讨血管性痴呆的发病机制及防治至关重要。目前研究认为血管性痴呆与Aβ在脑组织中沉积关系密切。本实验通过观察丁苯酞（NBP）对血管性痴呆大鼠认知功能及海马区Aβ表达的影响，探讨NBP对血管性痴呆的作用机制及其防治，为临床应用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠40只，购自济宁市任城区鲁原动物饲养经营部，体质量250～300g，饲养温度18～25℃，湿度60%～70%，普通饲料喂养，自由摄食与饮水，自然光照，大鼠术前12h禁食不禁水。动物分组及干预：通过Morris水迷宫测试筛选出健康雄性SD大鼠24只，随机分为模型组、对照组、丁苯酞低剂量组、丁苯酞高剂量组4每组再按取材时间不同分为4周组和6周组，每组5只。

1.2药物及试剂丁苯酞（石药集团提供），兔抗鼠Aβ抗体（北京博奥森生物技术有限公司），二抗及DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司），10%水合氯醛，4%多聚甲醛。

1.3模型制备采用Olsson方法结扎双侧劲总动脉建立动物模型，假手术组分离但不结扎劲总动脉。大鼠术前12h禁食，不禁水。10%水合氯醛4mL／kg腹腔麻醉，动物仰卧固定，颈前正中切口，钝性分离暴露双侧颈总动脉，埋线结扎，缝合切口。对照组仅做颈前切口，钝性分离双侧颈总动脉，不行结扎。术后每日肌内注射青霉素，连续3d。

1.4入选标准痴呆标准：以对照组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值，计算每只大鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例，该值＞20%定为痴呆鼠。将符合痴呆标准的大鼠随机纳入实验分组。

1.5给药方法从造模后1个月开始灌胃治疗，丁苯酞低剂量组、丁苯酞高剂量组分别灌服丁苯酞60mg／（kg·d）、120mg／（kg·d），丁苯酞用花生油稀释至2mL，模型组、对照组给以等量花生油灌胃。

1.6行为学检测采用 Morris水迷宫实验装置检测大鼠行为学，以逃避潜伏期代表大鼠认知能力，逃避潜伏期越短，认知能力越强。

1.7标本采集与组织学检查分别于连续灌胃4周和6周后取材。将各组大鼠分别用10%水合氯醛腹腔过量麻醉后，暴露心脏，先用37℃生理盐水250mL经升主动脉快速冲洗去除红细胞，后用4%多聚甲醛（pH值7.4）约500mL先快后慢灌注，至动物呈僵硬状态，后断头取脑，4%多聚甲醛后固定24～48h，石蜡包埋切片，取海马区脑组织连续4μm厚切片，进行免疫组化染色。在40×10倍光镜下随机选择5个不重叠视野，做免疫反应阳性细胞数计数，结果取5个视野的平均值。

1.8图像分析采用IPP6.0分析计数免疫组化阳性细胞数（胞浆着色呈棕黄色或棕褐色，部分细胞胞核着色）。

1.9统计学处理应用SPSS统计软件，检测结果用（s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，2组间比较采用SNK法。

2 结果

2.1各组大鼠水迷宫实验学习、记忆成绩比较在术后各时间点，经Morris水迷宫训练的模型组大鼠逃避潜伏期较对照组明显延长，认知功能下降（P＜0.05）；经丁苯酞治疗后发现，丁苯酞治疗组的逃避潜伏期较模型组明显缩短（P＜0.05），说明丁苯酞可以改善血管性痴呆大鼠的认知功能。见表1。

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期及跨平台次数比较（s，s）

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期及跨平台次数比较（s，s）

与模型组比较，▲P＜0.05；与低剂量组比较，★P＜0.05

组别 n 逃避潜伏期（4周）逃避潜伏期（6周）对照组▲★

2.2各组大鼠海马Aβ阳性细胞表达比较各时间点可见Aβ在假手术组海马区有少量表达。模型组及治疗组海马区Aβ阳性细胞数目增多（P＜0.05）。与模型组相比，治疗组海马区Aβ阳性细胞数目降低（P＜0.05），其中高剂量丁苯酞组较低剂量丁苯酞组Aβ表达减少（P＜0.05）。且随用药时间的延长，阳性细胞数也呈下降趋势（P＜0.05）。见表2。

表2 不同时间点各组大鼠脑组织中Aβ的免疫阳性细胞数比较（s，s）

表2 不同时间点各组大鼠脑组织中Aβ的免疫阳性细胞数比较（s，s）

与模型组比较，▲P＜0.05；与低剂量组比较，★P＜0.05

组别 4周 6周对照组27.00±1.87 28.20±1.92模型组 68.4.00±3.85 72.80±5.54丁苯酞低剂量组 53.40±1.82▲ 57.00±1.58▲丁苯酞高剂量组 41.80±1.64▲★ 44.60±2.30▲★

3 讨论

本实验大鼠的逃避潜伏期变化提示模型组大鼠发生认知功能障碍，不同剂量丁苯酞治疗后大鼠认知功能有所改善，且高剂量组较低剂量组改善明显。本实验通过免疫组化染色观察Aβ在脑组织尤其在海马中的表达变化，模型组海马区Aβ阳性细胞数量随着缺血时间延长而逐渐增长，应用丁苯酞后发现阳性细胞数量降低，且高剂量组较低剂量组下降明显。

丁苯酞是从芹菜籽中提取出来的左旋体，后经人工合成为消旋体，可阻断缺血性脑损伤的多个病理环节，具有较强的抗脑缺血作用。海马是参与空间学习记忆的重要结构，对缺血缺氧损伤十分敏感。2VO模型慢性脑缺血时由脑部低灌注引起的海马神经元损伤，通常被认为是VD进程中学习记忆能力障碍的病理基础［2］。现代研究发现，缺血性脑损伤可引起脑组织内Aβ水平有所增多［3］。2VO造成的慢性缺血不仅导致海马CA1区锥体细胞损伤，且可使APP裂解异常，生成Aβ增加［4］。脑内Aβ增多可通过线粒体途径引起细胞内环境改变，导致神经细胞凋亡，Aβ的过量产生还可能导致APP非淀粉样代谢途径减少，使神经细胞对许多损伤的敏感性大大增加［5］，这些因素最终导致认知功能障碍。本实验结果显示模型组海马区Aβ阳性细胞数量随着缺血时间延长而逐渐增长，应用丁苯酞后发现阳性细胞数量较模型组明显降低，且高剂量组较低剂量组下降明显。丁苯酞可能通过减轻慢性缺血时Aβ的表达，抑制细胞色素C从线粒体内释放入胞浆诱导的神经细胞凋亡，减轻其神经毒性作用，保护脑细胞，改善认知功能，为血管性痴呆的临床用药及疾病防治提供一定依据。

［1］Gold G.Diagnosis and treatment of vascular dementia ［J］.Praxis（Bern），2004，93（33）：1 311－1 316.

［2］Lorrio S，Negredo P，Roda JM，et al.Effects of memantine and galantamine given separately or in associat ion，on memory and hippocam pal neuronal loss after tran sient global cerebral ischemia in gerbils［J］.B rain Res，2009，1 254：128－137.

［3］Jendroska K，Hofmann OM，Patt S.Amyloid beta peptide and precursor protein（APP）in mild and severe brain ischemia［J］.Ann N Y Acad Sci，1997，826：401.

［4］Weinstock M，Shoham S.Rat models of dementia based on reductions in regional ucose metabolism，cerebral blood flow and cytochrome oxidase activity［J］.J Neural Transm，2004，111（3）：347.

［5］Ji ZS，Miranda RD，Newhouse YM，et al.Apolipoprotein E4potentistes amyloid beta prptide－induced lysosomal leakage and apoptosis in neuronal cells JJ［J］.Biol Chem，2002，277（24）：21 821.