尿液肾损伤分子1:预测梗阻性肾病肾脏预后的生物学标志物

谢园园 牟 姗 薛 蔚 蒋 晨 徐维佳 倪兆慧

根据The North American Pediatric Renal Transplant Cooperative Study (NAPRTCS)的数据显示[1-3],梗阻性肾病是导致成人急性肾损伤(AKI)的主要原因之一。梗阻性肾病起初肾功能缓慢下降,一旦发生AKI，患者肾功能会出现急剧恶化。在疾病早期发生AKI可能会加速疾病的进程,更早进入终末期肾病(ESRD)[4]。目前临床上采用的传统的AKI诊断标志物——血清肌酐(SCr)或尿量标准在诊断时间上往往存在一定滞后性,有碍于临床的早期预防和干预[5]。近年来,早期预测AKI发生的生物学标志物已成为AKI研究领域的热点,其中包括一些反映肾小管损伤的指标,如肾损伤分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白分子(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)。一些实验室及临床研究已发现KIM-1和NGAL可较早预测AKI的发生,但是在梗阻性肾病所致AKI中的应用尚缺乏临床研究。在梗阻性肾病的发展过程中,KIM-1、NGAL能否作为疾病预后的评定指标,尚需进一步探讨。本研究通过比较、分析不同时间点尿液KIM-1(uKIM-1)、尿液NGAL(uNGAL)的水平,评估其在梗阻性肾病所致AKI中的诊断价值,并进一步探讨其作为预测肾脏预后的生物学指标的潜在价值。

对象和方法

研究对象收集2010年8月至10月在上海交通大学医学院附属仁济医院住院的经泌尿系超声检查、CT断层扫描或肾脏核素扫描等诊断,手术明确的梗阻性肾病患者(年龄≥18岁、性别不限、临床资料完整)。排除标准：(1)未成年患者；(2)尿毒症且已行规律性血液透析、规律性腹膜透析的患者；(3)其他原因引起的AKI,存在免疫系统疾病、实体肿瘤或其他并发症的患者；(4)临床症状提示存在急慢性感染的患者。

尿液标本留取所有患者在术前和术后4h、8h、12h、24h、48h及72h留取新鲜尿液各10 ml。离心机2 000 r/min离心15 min后取上清液置于Eppendorf管,于-80℃冰箱保存。

指标检测

uKIM-1测定 uKIM-1采用ELISA方法进行检测。试剂盒由美国R&D公司生产。根据标准曲线计算待测样本所对应得浓度。所有uKIM-1浓度均用同步尿肌酐校正后以pg/(mg·Cr)表示。

uNGAL测定 uNGAL采用ELISA方法进行检测。试剂盒由荷兰Hycult biotechnology公司生产。根据标准曲线计算待测样本所对应得浓度。所有uNGAL浓度均用同步尿肌酐校正后以ng/(mg·Cr)表示。

其他指标 血清和尿肌酐浓度使用酶法检测,采用MDRD公式估算肾小球滤过率(eGFR),eGFR=186×(SCr/88.4)-1.154×年龄-0.203×(0．742,女性)[6]。测量指标还包括:血脂、全血细胞、血清白蛋白(Alb)、肝功能,24h尿蛋白定量、尿白蛋白(uAlb)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平等。

研究方法根据梗阻性肾病患者是否发生AKI,将患者分成AKI组及非AKI组。AKI定义为肾功能在48h内突然减退,表现为SCr升高,绝对值≥26.4 μmol/L；或SCr较基础值升高≥50%[7]。随访1年,根据患者肾功能情况将患者分成恢复组及未恢复组。肾功能恢复定义为SCr浓度降至AKI发生前的基础水平或较基础值升高<50%；或SCr水平保持在正常范围。

统计学方法采用SPSS13.0统计软件包处理数据。正态分布的计量资料采用平均数±标准差表示,两组间比较采用t检验。非正态分布的资料采用中位数(四分位数间距)表示,组间比较采用秩和检验。相关性分析采用Spearman相关分析。运用ROC曲线及曲线下面积(AUC)对uKIM-1、uNGAL诊断AKI的敏感度和特异度进行评价。COX多因素回归分析影响患者肾脏预后的相关危险因素。患者肾脏存活率使用Kaplan-Meier生命生存曲线来进一步分析。P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为统计学差异显著。

结 果

一般情况自2010年8月至10月间,共筛选51例患者,剔除存在并发症且伴发感染17例、失随访4例，最终入选30例梗阻性肾病患者,平均年龄55.13±11.26岁(38～76岁)。男女比例为2.75∶1,其中男性22例(73.33%),平均年龄58.27±11.42岁；女性8例(26.67%),平均年龄:46.5±4.66岁。SCr水平为547 μmol/L(67.8～923 μmol/L),eGFR:7 ml/(min·1.73m2)[5～93 ml/(min·1.73m2)],24h尿蛋白总量:0 g/24h(0～1.98 g/24h),uAlb:88.22 mg/g(19.62～140.43 mg/g),uNAG:19.59 U/mg(14.93～55.64 U/mg),uKIM-1:432.32 pg/(mg·Cr)[165.40～700.00 pg/(mg·Cr)],uNGAL:456.03 ng/(mg·Cr)[211.97～1 312.53 ng/(mg·Cr)]。与正常值比较,梗阻性肾病患者谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血脂、血红蛋白(Hb)、Alb等均在正常范围(表1)。

表1 AKI组与非AKI组一般情况及实验室检查结果

AKI组与非AKI组间比较发生AKI患者18例,非AKI患者12例。二组间比较患者年龄、男女比例、24h尿蛋白总量、肝功能、血脂等水平无统计学差异。AKI组uNAG、uAlb明显高于非AKI组。非AKI组的血Hb、Alb水平高于AKI组。比较AKI组与非AKI组uKIM-1、uNGAL经尿肌酐校正后的水平,AKI组明显高于非AKI组(P<0.01)(表1)。

uKIM-1、uNGAL诊断梗阻性肾病所致AKI的准确性分析Spearman相关分析uKIM-1与SCr呈正相关(r=0.497,P=0.002),与eGFR呈负相关(r=-0.485,P=0.002)(图1)。患者uNGAL水平与Scr呈正相关(r=0.553,P<0.001),与eGFR呈负相关(r=-0.619,P<0.001)(图2)。

ROC曲线分析显示,uKIM-1的AUC为0.943,P=0.002。当检测的截点为338.26 pg/(mg·Cr)时,其诊断梗阻性肾病所致AKI的敏感度和特异度分别为90%和85.7%。uNGAL诊断AKI的AUC为0.900,P=0.006。当检测的截点为261.76 ng/(mg·Cr)时,其诊断的敏感度90%,特异度85.7%(图3)。

图3 uKIM-1、uNGAL与梗阻性肾病所致AKI的曲线下面积

影响肾脏预后的相关因素分析随访1年,观察患者的肾功能情况,肾功能恢复组患者20例,未恢复组10例,两组患者年龄、男女比例、24h尿蛋白总量、uNAG、肝功能、血脂等水平均无统计学差异。未恢复组uKIM-1、uNGAL、uAlb高于恢复组,Hb低于恢复组(P<0.05)。

观察肾功能未恢复组与恢复组不同时间点uKIM-1、uNGAL、SCr水平变化。结果显示未恢复组术后72h uKIM-1水平显著高于恢复组,术前、术后4h及72h uNGAL水平均显著高于恢复组(图4)。而比较两组间SCr水平无明显统计学差异。

图4 1年后肾功能未恢复组与恢复组各时间点uKIM-1、uNGAL水平变化

对肾功能未恢复组进行逐步COX回归分析结果显示,术后72h uKIM-1是肾脏预后的危险因素(表2)，各时间点uNGAL水平与不良肾脏预后无明显相关性。

ROC曲线分析预测肾脏预后的准确性,术后72h uKIM-1曲线下面积为0.912,P=0.003。当检测的截点为100.23 pg/(mg·Cr)时,其敏感度和特异度分别为85.7%和84.6%(图5)。当术后72h出现uKIM-1>156.00 pg/(mg·Cr),与不良肾脏预后呈明显相关性(图6)。

表2 影响患者长期肾脏预后的相关危险因素

图5 术后72h uKIM-1预测肾脏预后的曲线下面积

图6 术后72h尿液肾损伤分子1(uKIM-1)与肾脏预后

讨 论

梗阻性肾病是因尿流障碍而导致肾脏功能和器质性损害的疾病。其主要机制是:(1)肾小管管腔扩张、细胞表型转化、细胞凋亡；(2)肾脏间质炎症；(3)球管失衡,逐渐间质纤维化[8]。这三个过程相互作用,互相重叠,最后导致肾小管萎缩,肾脏间质纤维化,肾单位缺失。梗阻性肾病一旦发生AKI,肾功能预后差,并最终进展为ESRD。评估和管理梗阻性肾病患者的临床挑战在于选择手术时机和确立判断预后的指标[9]。

KIM-1是一种跨膜蛋白,在正常肾脏中不表达,AKI临床研究和动物模型研究均显示在肾脏病患者肾缺血和肾毒性损伤时肾近端小管细胞大量分泌KIM-1[10-13]。在肾近曲小管尖端处KIM-1浓度最高,尖端是肾小管最易受损的部位[14]。在临床前实验[15],KIM-1已被证明是出色的肾毒性损伤标志物,在13个不同的AIK模型研究中显示,uKIM-1水平与肾小管损伤程度相关。尤其是轻微肾小管损伤时,uKIM-1较SCr、血尿素氮、uNAG更敏感。Liangos等[16]前瞻性研究观察了103例心肺旁路术后的患者的KIM-1水平,结果显示,心外科术后早期AKI患者KIM-1普遍较其他指标提早2h升高。Zhang等[17]观察62例患者的移植肾活检发现,在所有急性肾小管损伤及92%发生急性细胞排斥反应的患者肾组织KIM-1表达升高。本研究中,梗阻性肾病所致AKI组患者uKIM-1水平显著升高,与eGRF水平呈负相关,提示uKIM-1水平的升高,可反映eGFR的下降。uKIM-1诊断AKI的AUC达0.943。

Chaturvedi等[18]研究证实,KIM-1的表达将持续存在,直至损伤的肾小管细胞完全修复。一项对不同病因的肾脏病患者进行肾穿刺活检的大规模临床研究结果显示,患者近端肾小管上皮细胞都分泌KIM-1,组织KIM-1的表达与纤维化和炎症有关[19]。uKIM-1水平能反映组织KIM-1水平,与肾间质炎症和肾功能相关。这提示KIM-1不仅是急性肾近端小管损伤的生物学标志物,也是肾小管间质慢性炎症及纤维化改变的标志物。Waanders等[20]的一项回顾性研究显示,非糖尿病蛋白尿患者进行降蛋白尿治疗后,尿液中KIM-1排泄下降,提示uKIM-1可能成为评价疗效的指标。uKIM-1可能是持续肾小管损害的无创性生物学标志物。我们检测梗阻性肾病患者不同时间点的uKIM-1水平变化,并对患者肾功能情况进行了1年的随访发现,解除梗阻术后72h的uKIM-1水平在肾功能未恢复患者及肾功能恢复患者间存在显著差异,COX回归分析显示术后72h uKIM-1是肾脏预后的危险因素,与不良预后呈明显相关性。

NGAL是一种分子量为25 kDa的蛋白质,主要由中性粒细胞分泌,近端肾小管细胞等各种上皮细胞也均可分泌[21]。正常的肾脏、肺、胃和结肠组织中NGAL表达较低,然而上皮细胞受到损害时NGAL表达显著升高,主要是由肾小管上皮细胞分泌并释放[10]。Mishra等[22]在缺血性肾损伤模型中发现,肾小管内NGAL基因和蛋白的表达在短期内出现大幅度升高,由此推测uNGAL可作为缺血性AKI的生物学标志物。在小鼠动物模型研究和AKI的临床研究中,利用基因芯片分析,证明NGAL是肾脏缺血和肾毒性损害后最早最显著的敏感基因之一[23]。在一些临床前试验中也发现,在AKI早期血和尿中即可检出NGAL蛋白,这一改变早于肾脏的功能性改变[24]。许多临床研究以NGAL作为AKI的生物学标记,例如重症监护病房中AKI患者,心外科手术后和肾移植术后的AKI患者,观察其血尿NGAL的升高和SCr的变化。用蛋白印迹分析测定NGAL,AKI患者2～6h内NGAL水平升高超过10倍,而SCr在术后24～72h才上升基线值的50%。在这些研究中,血尿NGAL是AKI的独立预测指标,测量2h的血、尿NGAL的AUC为0.998和0.92[25]。本研究中,uNGAL的检测截点为261.76 ng/(mg·Cr)时,其诊断AKI的AUC为0.90,敏感度和特异度分别为90%和85.7%。荟萃分析显示,uNGAL不但有助AKI的早期诊断,并且还可用于预测患者是否需行肾脏替代治疗及短期预后[26]。本研究随访1年,比较肾功能未恢复组与恢复组间不同时间点uNGAL水平的变化发现,未恢复组解除梗阻术前、术后4h及72h uNGAL水平均显著高于恢复组,但是进一步回归分析显示其与不良肾脏预后无明显相关性。由于本研究样本较小,uNGAL在预测肾脏预后中的价值有待进一步研究。

NAG是细胞溶酶体内水解酶之一,广泛存在于人体各组织,肾组织中含量较高,尤多见于近曲小管上皮细胞。NAG也是近端肾小管损伤的生物学标志物,目前已广泛用于临床[27,28]。本研究中,随访1年后肾功能未恢复组与恢复组uNAG水平无明显差异,与不良肾脏预后无明显相关性。uNAG在近端肾小管发生结构性损伤后才升高[29]。

本研究是一个单中心小样本的研究,存在一些不足之处,仅随访了1年患者的肾功能变化,未进一步随访uKIM-1和uNGAL水平的变化。因此,尚需更大样本的多中心研究,同时随访肾脏疾病进程中uKIM-1和uNGAL水平的变化,进一步验证这两个生物学标志物在监测肾脏预后中的价值。

综上所述,uKIM-1和uNGAL在梗阻性肾病所致AKI中诊断的准确性较高,可作为临床上AKI的诊断标志物。同时,uKIM-1还能较准确的预测梗阻性肾病患者的肾脏预后,可作为梗阻性肾病预后不佳的早期筛查指标,帮助临床医师及早对这类患者进行干预,防止疾病进展。

1 Smith JM,Stablein DM,Munoz R,et al.Contributions of the transplant registry:The 2006 Annual Report of the North American Pediatric Renal Trials and Collaborative Studies (NAPRTCS).Pediatr Transplant,2007,11(4):366-373.

2 Klahr S,Morrissey J.Obstructive nephropathy and renal fibrosis.Am J Physiol Renal Physiol,2002,283(5):F861-F875.

3 Chevalier RL,Thornhill BA,Forbes MS,et al.Mechanisms of renal injury and progression of renal disease in congenital obstructive nephropathy.Pediatr Nephrol,2010,25:687-697.

4 Dear JW,Yuen PS.Setting the stage for acute-on-chronic kidney injury.Kidney Int,2008,74(1):7-9.

5 Ferguson MA,Vaidya VS,Waikar SS,et al.Urinary liver-type fatty acid-binding protein predicts adverse outcomes in acute kidney injury.Kidney Int,2010,77(8):708-714.

6 Levey AS,Coresh J,Greene T,et al.Expressing the Modification of Diet in Renal Disease Study Equation for Estimating Glomerular Filtration Rate with Standardized Serum Creatinine Values.Clin Chem,2007,53(4):766-772.

7 Mehta RL,Kellum JA,Shah SV,et al.Acute Kidney Injury Network:report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury.Crit Care,2007,11(2):R31.

8 Chevalier RL.Obstructive nephropathy:towards biomarker discovery and gene therapy.Nat Clin Pract Nephrol,2006,2(3):157-168.

9 Chevalier RL.Biomarkers of congenital obstructive nephropathy:past,present and future.J Urol,2004,172(3):852-857.

10 Wasilewska A,Taranta-Janusz K,Dębek W,et al.KIM-1 and NGAL:new markers of obstructive nephropathy.Pediatr Nephrol,2011,26(4):579-586.

11 Huo W,Liu R,Zhang K,et al.WITHDRAWN:Kidney injury molecule-1:a novel kidney-specific injury molecule playing potential double-edged functions in kidney injury.J Nephrol,2012.

12 Han WK,Bailly V,Abichandani R,et al.Kidney injury molecule 1 (KIM-1):a novel biomarker for human renal proximal tubule injury.Kidney Int,2002,62(1):237-244.

13 Ichimura T,Asseldonk EJ,Humphreys BD,et al.Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells.J Clin Invest,2008,118(5):1657-1668.

14 Zhou Y,Vaidya VS,Brown RP,et al.Comparison of kidney injury molecule-1 and other nephrotoxicity biomarkers in urine and kidney following acute exposure to gentamicin,mercury,and chromium.Toxicol Sci,2008,101(1):159-170.

15 Vaidya VS,Ozer JS,Dieterle F,et al.Kidney injury molecule-1 outperforms traditional biomarkers of kidney injury in preclinical biomarker qualification studies.Nat Biotechnol,2010,28(5):478-485.

16 Liangos O,Tighiouart H,Perianayagam MC,et al.Comparative analysis of urinary biomarkers for early detection of acute kidney injury following cardiopulmonary bypass.Biomarkers,2009,14(6):423-424.

17 Zhang PL,Rothblum LI,Han WK,et al.Kidney injury molecule-1 expression in transplant biopsies is a sensitive measure of cell injury.Kidney Int,2008,73(5):608-614.

18 Chaturvedi S,Farmer T,Kapke GF.Assay validation for KIM-1:human urinary renal dysfunction biomarker.Int J Biol Sci,2009,5(2):128-134.

19 van Timmeren MM,van den Heuvel MC,Bailly V,et al.Tubular kidney injury molecule-1 (KIM-1) in human renal disease.J Pathol,2007,212(2):209-217.

20 Waanders F,Vaidya VS,van Goor H,et al.Effect of renin-angiotensin-aldosterone system inhibition,dietary sodium restriction,and/or diuretics on urinary kidney injury molecule 1 excretion in nondiabetic proteinuric kidney disease:a post hoc analysis of a randomized controlled trial.Am J Kidney Dis,2009,53(1):16-25.

21 Soni SS,Ronco C,Katz N,et al.Early diagnosis of acute kidney injury:the promise of novel biomarkers.Blood Purif,2009,28(3):165-174.

22 Mishra J,Ma Q,Prada A,et al.Identification of Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury.J Am Soc Nephrol,2003,14(10):2534-2543.

23 Devarajan P,Mishra J,Supavekin S,et al.Gene expression in early ischemic renal injury:clues towards pathogenesis,biomarker discovery,and novel therapeutics.Mol Genet Metab,2003,80(4):365-376.

24 Mori K,Lee HT,Rapoport D,et al.Endocytic delivery of lipocalin-siderophore-iron complex rescues the kidney from ischemia-reperfusion injury.J Clin Invest,2005,115(3):610-621.

25 Mishra J,Dent C,Tarabishi R,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery.Lancet,2005,365(9466):1231-1238.

26 Haase M,Bellomo R,Devarajan P,et al.Accuracy of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in diagnosis and prognosis in acute kidney injury:a systematic review and meta-analysis.Am J Kidney Dis,2009,54(6):1012-1024.

27 Kang HK,Kim DK,Lee BH,et al.Urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase and malondialdehyde as a markers of renal damage in burned patients．J Korean Med Sci,2001,16(5):598-602.

28 Han WK,Wagener G,Zhu Y,et al.Urinary biomarkers in the early detection of acute kidney injury after cardiac surgery.Clin J Am$oc Nephml,2009,4(5):873-882.

29 Kamijo-Ikemori A,Sugaya T,Kimura K.Urinary fatty acid binding protein in renal disease.Clinica Chimica Acta,2006,374(1-2):1-7.